РНК-интерференция

Обновлено: 02.10 16:04

Нобелевская премия в области медицины и физиологии за 2006 год присуждена американским генетикам Эндрю Файру (Andrew Fire) и Крэйгу Меллоу (Craig Mello). Исследователи открыли и описали механизм так называемой РНК-интерференции, при которой происходит избирательное подавление экспрессии генов, унаследованных организмом.

Крэйг Меллоу является сотрудником Медицинской школы Университета штата Массачусетс, Эндрю Файр работает в Медицинской школе Стэндфордского университета.

Их статья, описывающая механизм РНК-интерференции, появилась в 1998 году в журнале Nature. По мнению ученых, механизм РНК-интерференции был выработан в процессе эволюции в качестве средства защиты от вирусов, которые используют для собственного размножения клеточные РНК.

Суть РНК-интерференции заключается разрушении молекул РНК, несущих информацию о структуре гена, после присоединения к ним малых РНК, циркулирующих в цитоплазме клетки. РНК-интерференция зафиксирована у большинства эукариот.

Открытие механизма избирательного «отключения» генов может привести к созданию новых методов борьбы с наследственными заболеваниями, раком, а также вирусными инфекциями.

Nobel prize for genetic discovery

D r Mello on winning

Two US scientists have been awarded the Nobel Prize for medicine for their pioneering work in genetics.

The work of Dr Andrew Fire and Dr Craig Mello could lead to new treatments for a range of illnesses, including viral infections and cancer.

They discovered a phenomenon called RNA interference, which regulates the expression of genes.

The process has the potential to help researchers shut down genes which cause harm in the body.

This year's Nobel Laureates have discovered a fundamental mechanism for controlling the flow of genetic inormation Nobel citation

The breakthrough has also given scientists the ability to systematically test the functions of all human genes.

In its wake, many companies have been set up to develop research tools to make use of what has become a whole new industry.

Dr Craig Mello is based at the University of Massachusetts Medical School, and Dr Fire at Stanford University School of Medicine.

RNA interference occurs in both plants and animals.

It plays a key role in mobilising the body's defences against infection, and in keeping unstable genes under control.

The process is already being widely used in science as a method to study the function of genes.

Genetic instructions

The Nobel citation, issued by Sweden's Karolinska Institute, said: "This year's Nobel Laureates have discovered a fundamental mechanism for controlling the flow of genetic information."

Our genome operates by sending instructions for the manufacture of proteins from DNA in the nucleus of the cell to the protein synthesising machinery in the watery cytoplasm.

These instructions are conveyed by another form of genetic material called messenger RNA (mRNA).

In 1998, Dr Mello and Dr Fire published a paper in the journal Nature detailing how RNA interference can subvert this process - effectively shutting specific genes down.

Tiny snippets of RNA dupe the cell into destroying the gene's mRNA before it can produce a protein.

Scientists have speculated that the mechanism developed hundreds of millions of years ago as a way to protect organisms against invading viruses, which sometimes create double-stranded RNA when they replicate.

Huge importance

Professor Nick Hastie, director of the Medical Research Council's Human Genetics Unit, said the fact that the work had been recognised by the Nobel committee just eight years after it was published indicated just how important it had been.

He said: "It is very unusual for a piece of work to completely revolutionise the whole way we think about biological processes and regulation, but this has opened up a whole new field in biology."

Professor Hastie said previously RNA had been thought to have very little role in regulating genes - in fact some thought it nothing more than a by-product.

Dr Mello and Dr Fire's work had shown that in fact it plays a key role in gene regulation.

The Nobel Prize is worth $1.4m.

Серьезные надежды возлагаются на очень интересное направление - избирательное подавление синтеза вирусных белков с помощью механизма РНК-интерференции.

В клетках существует механизм, который мешает распространению вирусной инфекции - интерференция. Белки, которые участвуют в этом процессе, были названы интерферонами. В ответ на введение в клетки фрагментов нуклеиновой кислоты длиной более тридцати нуклеотидов (вирусы имеют значительно больший размер) в их цитоплазме запускается мощный интерфероновый ответ, блокирующий весь белковый синтез (т.е. происходит неспецифический защитный ответ клетки на вирусную инфекцию). И вот недавно открыт совершенно новый способ регуляции работы генов в клетках - механизм РНК-интерференции. Выяснилось, что в клетке существует специальный механизм, способный деградировать строго определенные РНК (без участия рибозимов) и таким образом полностью инактивировать её. Этот механизм деградации может быть направлен на любую конкретную РНК - клеточную, бактериальную или вирусную.

Суть механизма РНК-интерференции заключается в том, что при введении в клетки короткой двунитевой РНК (днРНК) она способна вызывать специфическое разрушение той мРНК, с которой имеет гомологию. Сначала днРНК разрезается специальным ферментом на короткие фрагменты размером от 19 до 21 пар нуклеотидов. После небольших химических модификаций эти короткие днРНК образуют специфический комплекс с определенными клеточными белками. В этом комплексе днРНК расплетается и становится однонитевой. Затем короткая однонитевая РНК в силу своей комплементарности взаимодействует со строго определенной мРНК (копией гена-мишени), что является сигналом для "разрезания" последней ферментами комплекса. Образующиеся в результате этого короткие фрагменты мРНК уже не способны обеспечивать синтез полноценного белка. Таким образом, конструируя различные днРНК можно подавлять синтез строго определенных белков в клетке, не изменяя при этом структуру кодирующих их генов.

Первые попытки применить РНК-интерференцию в качестве нового подхода к терапии ВИЧ-инфекции появились в 2002 г. Для того, чтобы использовать механизм РНК-интерференции, внутрь клеток нужно ввести готовые двухцепочечные молекулы РНК рис. 33 . Оптимальный размер таких синтетических РНК составляет 21-28 пар нуклеотидов. Если увеличить ее длину - клетки ответят выработкой интерферона и снижением синтеза белка. Но молекулы РНК синтезировать трудно, они не очень стабильны. Поэтому на практике пользуются возможностями, предоставляемыми рекомбинантными ДНК, которые, будучи перенесенными в клетки, обеспечивают синтез таких днРНК.

С целью воздействия на ВИЧ опробовано несколько вариантов РНК- интерференции. Если первоначально для подавления вируса использовали интерферирующие РНК к вирусным мРНК, то в дальнейшем пришли к выводу, что более целесообразным является направлять днРНК на клеточные мРНК, такие как, например, мРНК, кодирующие вирусный рецептор CD4 и/или корецептор CCR5. Дело в том, что вирусные гены быстро видоизменяются, соответственно изменяется нуклеотидная последовательность вирусной РНК. В результате этого конкретная искусственно синтезированная интерферирующая РНК становится мало эффективной к некоторым вариантам вируса. Клеточные же гены, обеспечивающие взаимодействие вируса с клеткой, стабильны (они изменяются чрезвычайно редко). По этой причине подавление их работы с помощью интерферирующих РНК происходит более надежно. Внимание было обращено на клеточные белки-рецепторы или корецепторы для ВИЧ. Если предотвратить синтез хотя бы одного из них, вирус не сможет проникать в клетку. На клетках, которые растут вне организма (in vitro), были использованы обе стратегии, и они дали положительный результат. Так, показано полное подавление инфицирования ВИЧ макрофагов с помощью комбинации коротких интерферирующих днРНК, направленных против клеточных и вирусных генов. Однократное применение днРНК обеспечивало долгосрочную защиту этих неделящихся клеток от вируса. Обнаружена также возможность подавления размножения ВИЧ в уже инфицированных клетках.

Использование интерферирующих РНК имеет ряд преимуществ по сравнению с антисмысловыми РНК (большая эффективность, меньшая токсичность). Однако до практического применения этой новой технологии к человеку пока еще дело не дошло. Трудность заключается в том, что двунитевые РНК очень нестабильны и быстро разрушаются в организме. Кроме того, надо обеспечить присутствие этих РНК в клетках, пораженных вирусом, а не вообще в организме. На сегодняшний день еще нет надежных способов доставки генов и РНК в отдельные клетки, не отработаны до конца приемы, обеспечивающие длительное пребывание РНК в организме.

РНК-интерференция: введение

Явление РНК-интерференции (RNA interference) было открыто в ходе экспериментов по подавлению экспрессии генов при помощи антисмысловой РНК у C. elegans . Предполагалось, что антисмысловая РНК после комплементарного узнавания мРНК препятствует ее трансляции . Однако в некоторых экспериментах было обнаружено, что инъекции контрольной смысловой РНК вызывают такой же эффект подавления экспрессии гена, как и инъекция антисмысловой РНК ( Fire et al., 1998 ). Более тщательный анализ показал, что агентом, нарушающим экспрессию, является не смысловая или антисмысловая РНК, а двухцепочечная РНК , содержащаяся в качестве примеси в обоих препаратах.

Термин "РНК-интерференция" для феномена специфического подавления экспрессии генов при введении двухцепочечной РНК был предложен Andrew Fire ( Fire et al., 1998 ; Timmons and Fire, 1998 ).

К этому времени был уже подробно исследован механизм действия двухцепочечной РНК в клетках млекопитающих ( Clemens, 1997 ), приводящий к прекращению трансляции всех мРНК независимо от последовательности двухцепочечной РНК. В отличие от этого эффекта двухцепочечной РНК, РНК-интерференция предполагает специфическое нарушение экспрессии только тех генов, которые обладают достаточно большой степенью гомологии с введенной двухцепочечной РНК.

В последующие годы эффективность РНК-интерференции была продемонстрирована у самых разнообразных беспозвоночных животных - трипаносомы, гидры, планарии, C. elegans, дрозофилы и некоторых других насекомых ( Kennerdell and Carthew, 1998 ; Lohmann et al., 1999 ; Ngo et al., 1998 ; Sanchez Alvarado and Newmark, 1999 ). Сиквенс-специфическое действие двухцепочечной РНК было также обнаружено и у позвоночных, в том числе на ранних стадиях развития млекопитающих, на которых, по-видимому, еще не действует неспецифическая система активации протеинкиназы PKR ( Wianny and Zernicka-Goetz, 2000 ; Yang et al., 2001 ).

Уже сразу после открытия РНК-интерференция стала использоваться как мощный и удобный способ специфического подавления экспрессии генов, исходя из их нуклеотидной последовательности, в том числе для массового скрининга генов ( Bargmann, 2001 ; Barstead, 2001 ; Maeda et al., 2001 ; Piano et al., 2000 ). Одновременно начались исследования самого механизма РНК-интерференции с использованием как генетического, так и биохимического подходов.

По мере выяснения действия двухцепочечной РНК в клетках беспозвоночных становилось все более ясно, что феномен РНК-интерференции имеет много общего с другим явлением, открытым за несколько лет до этого у растений - косупрессией.

Косупрессия у растений была обнаружена в ходе опытов по введению путем трансгеноза дополнительных копий генов в надежде получить увеличение экспрессии и в результате - необходимый фенотип. В противоположность ожиданиям исследователей, у трансгенных растений часто обнаруживалось не увеличение, а подавление экспрессии генов, при этом в таких случаях оказывались подавленными не только введенные трансгены, но и нормально экспрессирующийся до этого клеточный ген, обладающий гомологией с введенными трансгенами ( van der Krol et al., 1990 ).