РНК (1113570), страница 2

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 2)

Сходное с косупрессией явление было обнаружено также у гриба Neurospora и названо quelling ( Romano and Macino, 1992 ). Сейчас становится ясно, что РНК-интерференция и косупрессия у растений входят в широкий круг явлений, названный зависимым от гомологии подавлением экспрессии генов (HDGS) (homology-dependent gene silencing) ( Birchler et al., 2000 ; Cogoni and Macino, 1999b ; Matzke et al., 2001a ). Сюда относятся все явления, при которых наблюдается подавление экспрессии как на транскрипционном, так и на пост-транскрипционном уровне, требующее наличия высокого уровня гомологии между взаимодействующими генами.

По-видимому, различные явления HDGS могут осуществляться разными механизмами, включающими ДНК-ДНК-, ДНК-РНК- и РНК-РНК-взаимодействия, и необязательно с участием двухцепочечной РНК.

С другой стороны, в последнее время начинает проясняться связь многих, казавшихся ранее различными, феноменов HDGS. Вполне возможно, что дальнейшие исследования приведут к представлению о едином механизме HDGS, проявляющемся на транскрипционном или пост-транскрипционном уровне в различных системах.

РНК-интерференция: гены, необходимые для осуществления процесса

Значительный прогресс в изучении РНК-интерференции и PTGS у растений был достигнут благодаря скринингу генов, необходимых для этих процессов ( Ketting et al., 1999 ; Tabara et al., 1999 ). Поскольку для скрининга нужно исследование большого количества особей, введение двухцепочечной РНК осуществлялось не путем инъекций, а с использованием бактерий, которые благодаря наличию специального вектора производили двухцепочечную РНК к жизненно-важному гену C. elegans ( Tabara et al., 1999 ). Добавление таких бактерий в корм приводило к стерильности особей дикого типа вследствие нарушения функции pos-1-гена , экспрессирующегося в герминальных клетках и необходимого для развития эмбрионов. После мутагенеза были отобраны потомки особей, оказавшихся фертильными в результате нарушения в системе РНК-интерференции.

Необходимо отметить, что при такой системе поиска мутаций невозможно выявить жизненно важные гены, мутации по которым летальны. Кроме того, скрининг не позволяет идентифицировать гены с дублированными функциями, т.к. в этом случае мутация по одному гену компенсируется нормальной работой другого. Несущие мутации в названных rde-генах (RNAi deficient) особи C. elegans практически нечувствительны к инъекциям двухцепочечной РНК. Для нескольких rde-генов были установлены соответствующие открытые рамки считывания путем восстановления чувствительности к двухцепочечной РНК после инъекции плазмид, содержащих соответствующие гены. Всего в результате скрининга было найдено четыре rde-гена.

Мутации в rde-генах не вызывали каких-либо существенных фенотипических проявлений, кроме резистентности к РНК-интерференции, однако мутации в генах rde-2 и rde-3 приводили также к активации транспозиций мобильных элементов нескольких различных семейств ( Tabara et al., 1999 ). У мутантов по генам rde-1 и rde-4 таких свойств обнаружено не было.

Активация транспозиций при мутациях в нескольких rde-генах заставила исследователей проанализировать чувствительность к двухцепочечной РНК при мутациях в генах, выявленных при скрининге на повышенную частоту транспозиций мобильных элементов (так называемых mut-генов ) ( Ketting et al., 1999 ). В результате было показано, что мутации в некоторых mut-генах ( mut-2 , mut-7 и mut-14 ) приводят не только к увеличению частоты транспозиций мобильных элементов, но и к устойчивости к инъекциям двухцепочечной РНК ( Ketting et al., 1999 ; Tijsterman et al., 2002 ). У других mut-генов такие свойства не найдены.

Таким образом в сумме было идентифицировано 7 генов, участвующих в РНК-интерференции у C. elegans, 5 из которых отвечают и за контроль перемещений транспозонов. Эти исследования впервые показали, что возможной физиологической ролью РНК-интерференции у С. elegans является подавление активности мобильных элементов.

Мутации по генам rde и mut рецессивны за исключением гена mut-2, мутация по которому доминантна ( Tabara et al. 1999 ).

Использованная методика скрининга была направлена в первую очередь на выявление генов, необходимых для РНК-интерференции в герминальных тканях. Соответственно все 7 найденных генов (rde1-4, mut-2, mut-7 и mut-14) строго необходимы для осуществления РНК-интерференции в герминальных тканях ( Ketting et al., 1999 ; Tabara et al., 1999 ; Tijsterman et al., 2002 ).

Однако у животных, мутантных по генам rde-2 и mut-7, в отличие от мутаций по другим генам групп mut и rde, РНК-интерференция в соматических тканях подавляется не полностью, хотя ее эффективность оказывается значительно сниженной ( Tabara et al. 1999 ). Можно предполагать, что продукты двух этих генов необходимы в первую очередь для РНК-интерференции в клетках зародышего пути, а в соматических тканях их функции продублированы продуктами других генов, не идентифицированных к настоящему моменту.

РНК-интерференция: моделирование процесса в бесклеточной системе

Огромный прогресс при изучении механизма РНК-интерференции был достигнут благодаря созданию бесклеточной in vitro системы, моделирующей основные черты РНК-интерференции. В то же время при интерпретации и сравнении результатов, полученных in vitro и in vivo, необходимо проявлять осторожность, так как бесклеточная система может моделировать лишь краткосрочные процессы и не отражает всю сложность явления in vivo, например, при долгосрочном наследовании эффекта РНК-интерференции, как и ткане-специфичные особенности механизма.

В отличие от генетических исследований РНК-интерференции, выполненных в первую очередь на C. elegans, в биохимических исследованиях в основном используются бесклеточные экстракты, полученные из эмбрионов или культуры клеток Drosophila melanogaster.

РНК-интерференция: образование siRNA (gRNA)

Первым шагом на пути к установлению биохимического механизма РНК-интерференции была демонстрация того, что искусственно синтезированная мРНК подвергается специфической ATP-зависимой деградации в эмбриональном экстракте при добавлении в систему гомологичной двухцепочечной РНК ( Tuschl et al. 1999 ; Zamore et al. 2000 ). Однако, в противоположность инъекциям in vivo, реакция in vitro требует избытка двухцепочечной РНК относительно мРНК, что может свидетельствовать о нарушенном in vitro механизме усиления сигнала РНК-интерференции.

Преинкубация двухцепочечной РНК с экстрактом перед добавлением мРНК значительно усиливает эффект РНК-интерференции, что говорит о том, что двухцепочечная РНК должна сначала каким-то способом активироваться для индукции деградации мРНК ( Tuschl et al., 1999).

В согласии с результатами, полученными in vivo, увеличение длины двухцепочечной РНК приводило к более сильному эффекту деградации in vitro ( Tuschl et al., 1999 ). Дальнейшие эксперименты на бесклеточной системе показали, что внесенная в экстракт двухцепочечная РНК подвергается процессингу с образованием коротких РНК длиной в 21-23 нуклеотида ( Zamore et al. 2000 ), при этом гомологичная мРНК также расщепляется на короткие фрагменты аналогичной длины (21-23 нуклеотида) ( Hammond et al. 2000 ; Zamore et al. 2000 ).

Короткие молекулы РНК размером порядка 25 нуклеотидов впервые обнаружили А.J. Hamilton и D.C.Baulcombe ( Hamilton and Baulcombe, 1999 ) при изучении косупрессии (PTGS) у растений. В этой работе было определено, что в трех различных случаях PTGS, индуцированного трансгенами, а также в случае PTGS, вызванного вирусом, в клетках растений обнаруживаются короткие смысловые и антисмысловые РНК, соответствующие по последовательности матричной РНК-мишени, при этом количество коротких РНК коррелирует с силой косупрессии.

Впоследствии образование коротких (21-25 нуклеотидов) РНК было показано при введении двухцепочечной РНК в организм C. elegans ( Parrish et al. 2000 ) и в эмбрионы дрозофилы in vivo ( Yang et al. 2000 ). Это привело к предположению, что именно короткие (21-23 нуклеотида) РНК, образующиеся из длинных двухцепочечных РНК-дуплексов, являются активной формой сигнала для деградации мРНК при РНК-интерференции у животных и PTGS у растений.

Для обозначения таких молекул был предложен термин small interfering RNA ( siRNA ) или guide RNA ( gRNA ).

Общая модель механизма РНК-интерференции предполагает существование двух основных стадий: на первой стадии происходит процессинг двухцепочечной РНК на короткие 21-23 нуклеотидные РНК, на второй стадии siRNA в комплексе с белками узнают и направляют деградацию гомологичной мРНК.

РНК-интерференция: процессинг двухцепочечной РНК

На первой стадии РНК-интерференции происходит процессинг двухцепочечной РНК. Расщепление двухцепочечной РНК с образованием коротких продуктов длиной в 21-23 нуклеотида было продемонстрировано как на бесклеточной системе эмбриональных экстрактов дрозофилы ( Zamore et al. 2000 , Elbashir et al. 2001 ), так и in vivo в результате иньекций радиоактивно меченной двухцепочечной РНК в эмбрионы дрозофилы ( Yang et al. 2000 ).

Скорость расщепления двухцепочечной РНК коррелирует со скоростью подавления экспрессии гомологичного гена ( Yang et al. 2000 , Elbashir et al. 2001 ). При этом комплекс, осуществляющий разрезание двухцепочечной РНК (как in vivo так и in vitro), не требует присутствия гомологичной мРНК, то есть процессиг двухцепочечной РНК происходит независимо от наличия мишени ( Zamore et al. 2000 ; Yang et al. 2000 ).

Добавление в среду негомологичной двухцепочечной РНК снижает активность РНК-интерференции как in vitro ( Tuschl et al 1999 ), так и in vivo ( Yang et al. 2000 ), что говорит о зависимости процессинга двухцепочечной РНК с образованием siRNA от фактора, количество которого ограничено. Этот фактор осуществляет процессинг независимо от нуклеотидной последовательности и длины двухцепочечной РНК ( Zamore et al. 2000 ; Yang et al. 2000 ; Bernstein et al. 2001 , Elbashir et al. 2001 ), однако, по-видимому, он не может узнавать и процессировать двухцепочечную РНК короче 30-38 пар нуклеотидов ( Elbashir et al., 2001b ).

6

Характеристики

Список файлов учебной работы