Диссертация (Нейропротективное действие ключевых протеиназ гемостаза), страница 2

Важность работы для фундаментальной науки и практической медицины обусловлена необходимостью понимания молекулярных механизмов нейропротекторного действия протеиназ гемостаза при эксайтотоксичности, которая является одним из основных компонентов ишемии мозга и нейродегенеративных заболеваний.

Показано, что исследованные протеиназы - тромбин, ФХа и АРС - в узком диапазоне низких концентраций через активацию подтипов PAR, защищают гиппокампальные и кортикальные нейроны от гибели при эксайтотоксичности. Протекторное действие тромбина на нейроны при эксайтотоксичности реализуется через PAR1, ФХа - через неизвестный подтип PAR, а АРС - через EPCR и PAR1.

Нейропротекторное действие тромбина и ФХа обусловлено уменьшением дестабилизации кальциевого гомеостаза нейронов при глутаматной эксайтотоксичности. АРС защищает нейроны от гибели, блокируя активацию NF-kB, вызванную токсическим действием на нейроны высоких концентраций глутамата или тромбина.

Полученные данные о протекторном действии протеиназ в низких физиологических концентрациях на клетки при эксайтотоксичости позволяют отнести тромбин, ФХа и АРС к клеточным регуляторам физиологических и патофизиологических процессов.

Данные о прямом цитопротекторном действии протеиназ гемостаза могут служить основой для разработки новых подходов к лечению травматических и ишемических повреждений нервной ткани и создания на базе агонистов и антагонистов рецепторов PAR препаратов с анти-апоптотическими, анти-воспалительными и репаративными свойствами, защищающими клетки от гибели и восстанавливающими ткани при терапии данных повреждений.

Результаты этой работы могут найти применение в теоретической и экспериментальной физиологии, патофизиологии и фармакологии. Данные о новых функциях протеиназ гемостаза вне системы свертывания могут быть включены в курсы лекций по теме «Физиология и патофизиология гемостаза», «Нейрофармакологии».

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на I Съезде физиологов СНГ (Дагомыс, 2005); 4^thи 5^th International Symposium Focus 2006, 2008:Cerebral Ischemia and Stroke (Magdeburg, 2006, 2008); 18^th International Congress of Fibrinolysis and Proteolysis (San Diego, 2006), XX Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007); 3^rd Intern Congress ”Neuroscience for Medicine and Psychology” (Sudak, Crimea, Ukraine, 2007); XXI Congress of ISTH (Geneva, 2007); VI Международном симпозиуме "Химия протеолитических ферментов" (Москва, 2007); XIX International Congress on Fibrinolysis and Proteolysis (Vienna, 2008); докладывались на отечественных и международных конференциях: «Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром. современные достижения» (Ярославль, 2005); «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006, 2007); «Нейроспецифические метаболиты и энзимологические основы деятельности ЦНС» (Пенза, 2006); «Протеолиз, механизмы его регуляции и роль в физиологии и патологии клетки» (Минск, 2007); «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 2006, 2007); «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (Москва, 2007). Результаты работы обсуждались на заседаниях кафедры физиологии человека и животных МГУ им. М.В.Ломоносова и лаборатории мембранологии с группой генетических исследований ГУ НЦЗД РАМН.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 40 научных работ в отечественной и зарубежной печати.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на стр., состоит из введения, обзора литературы, методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего отечественных и зарубежных источников. Работа иллюстрирована рисунками, содержит таблиц.

основные материалы и методы исследования

В работе были использованы следующие препараты: активированный протеин С (APC) и тромбин человека, фактор Ха быка, NaCl, KCl, CaCl₂, MgCl₂, KH₂PO₄, HEPES, глюкоза, глутамат, glutamax, ARAC, поли-D-лизин, гелданамицин, MTT(3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide), ЭГТА, 2-APB, дантролен, иономицин, тетродотоксин, NMDA, ФМСФ, ARAC, TritonX-100, поли-D-лизин (Sigma,USA); Fura-2/AM, Fura-2/FF, флуоресцентные красители Hoechst 33342, SYTO-13, SYTOX (Molecular Probes, Eugene OR, США); синтетический пептид-агонисты PAR1 (PAR1-AP, TFLLRN) и PAR2 (PAR2-AP, SLIGRL) (Biosyntan, Germany) и антагонисты PAR1 (YFLLRN, (Tyr¹)-TRAP-7) (Bachem Biochemica) и Mpr(Cha) (Mercaptopropionyl-F(Cha-Cha)RKPNDK-NH₂)( любезно предоставлен A. Kawabata, Япония); антитела: antiNF-kBp65 - (C22B4) rabbit mAb, анти-PAR1 (ATAP2, S-19), анти-PAR3 (H103, M-20), анти-EPCR (RCR-252, P-20); нейробазальная среда – А (“Gibco”), содержащая 2% Supplement B-27 (Gibco) и L-глутамин (Gibco); LDH-L реагент (Diagnostic Chemicals Limited, Канада); NF-kBp65 total kit ELISA (Biosource).

Все эксперименты с животными были выполнены в соответствии с этическими принципами и нормативными документами, рекомендованными Европейским научным фондом (ESF) и декларацией о гуманном отношении к животным.

Получение культуры гиппокампальных и кортикальных нейронов. Исследования проводили на первичных культурах нейронов гиппокампа (9-10 дневных) или коры (7-8 дневных), извлеченных из мозга 1-3 дневных крысят Вистар. Суспензию клеток (10⁶ клеток/мл) получали по ранее описанному методу (Ходоров и др., 2001) и переносили на покровные стекла, покрытые поли-D-лизином (10 мг/мл). Через час добавляли 1,5 мл культуральной среды (нейробазальная среда – А, содержащая 2% Supplement B-27 и 0.5 мМ L-глютамина). На 3-4 день добавляли арабинозид (ARAC, 10^-5М) на сутки для подавления роста глиальных клеток.

Оценка гибели нейронов. Гибель нейронов в культуре определяли через сутки после 30-минутного действия глутамата (100 мкМ) и исследуемых веществ, которые добавляли к клеткам, сменив временно культуральную среду на HEPES-солевой буфер (HBSS). Состав HBSS в мМ: NaCl – 145, KCl – 5, CaCl₂ – 1.8, MgCl₂ – 1.0 (без MgCl₂ в случае экспозиции клеток с глутаматом); Gly, 0.01; HEPES – 20, глюкоза – 5 (рН 7.4). Гибель оценивали двумя способами: биохимическими (с помощью MTT-метода (Castoldi et al., 1998) и по высвобождению из клеток лактатдегидрогеназы) и морфологическим. МТТ добавляли в культуральную среду до конечной концентрации 1 мг/мл и инкубировали клетки 3 часа при 37 ⁰С. Затем среду отбирали и добавляли DMSO для растворения формазанов. Оптическую плотность измеряли на иммуноферментном анализаторе «Униплан» АИФР-01 (ЗАО «Пикон») при 590 нм. Оценивали результаты в процентах по отношению к контролю. Второй способ оценки выживаемости был основан на измерении высвобождения лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в культуральную среду. Активность ЛДГ оценивали спектрофотометрическим методом при 340 нм на микропланшетном люминометре Аnthos Lucy1 (Anthos Labtec Instruments, Salzburg, Австрия) с помощью LDH-L реагента (Diagnostic Chemicals Limited, Charlottetown, PE, Канада). Процент выживаемости нейронов рассчитывали как (1  активность ЛДГ в среде / общая величина ЛДГ) х 100, где общая величина ЛДГ определялась как активность ЛДГ в культуральной среде после 15 минутной инкубации в 0,2% Triton Х-100 при 37⁰С для каждой культуры клеток в отдельности.

Морфологическая оценка гибели нейронов включала исследование ядерной фрагментации (апоптоза) с помощью флуоресцентного ДНК-тропного красителя Hoechst 33342 (абсорбция 360 нм, эмиссия 460 нм) (Liu et al., 1997) и витального красителя SYTO-13 (абсорбция 488 нм, эмиссия 590 нм) (Frey, 1995). Окрашенные клетки исследовали, подсчитывали визуально под флуоресцентным микроскопом (Axiovert 200 Zeiss, Германия) и количество апоптотических клеток выражали в процентах по отношению к общему количеству клеток.

Спектрофлуориметрические исследования.

Регистрация внутриклеточной концентрации кальция ([Ca²⁺]_i).

[Ca²⁺]_i измеряли спектрофлуориметрическим методом с помощью флуоресцентного зонда Fura-2/AM с высоким сродством к Ca²⁺ (Grynkewics et al.,1985) или Fura-2/FF c низкой аффинностью к Ca²⁺ (Hyrc et al., 1997). Спектр флуоресценции зонда смещается к более коротким волнам при увеличении связывания молекул зонда с Са²⁺. Клетки загружали зондом (5 мкМ) в течение 40 мин до начала опытов в культуральной среде, затем культуры отмывали HBSS. Стекло с клетками помещали в перфузионную камеру на столике инвертированного микроскопа (Axiovert 200, Zeiss, Германия). Для возбуждения флуоресценции использовали свет с двумя длинами волн 340 и 380 нм (поочередное освещение по 100-200 мс), длина волны эмиссии составляла 505  10 нм. Встроенная видеокамера (Roper Scientific, США) и компьютерная программа Metafluor 6.1 (Universal Imaging Corp., США) позволяли получать цифровую запись эксперимента и ее обрабатывать. В опытах определяли абсолютные значения [Ca²⁺]_i, используя калибровочные растворы по методике (Kiedrowski et al., 1994).

Иммунофлуоресцентное окрашивание.

Прикрепленные клетки промывали PBS и фиксировали в 4% параформальдегиде (25 мин). После отмывки (1х10 мин 120 мМ Na-фосфатом) блокировали неспецифическое связывание сывороткой (FSBB) и инкубировали клетки в течение ночи при 4⁰С с первичными антителами NF-kBp65 ((C22B4) rabbit mAb, 1:100) в FSBB. После этого клетки трижды отмывали и инкубировали 1,5 часа со вторичными антителами (Alexa 488 (1:500) или Alexa 546 (1:250)). Далее снова отмывали и инкубировали клетки с ядерным красителем SYTOX (1:10000, Molecular Probes) или с пропидиумом йодидом (1:500). Имиджи записывали с помощью инвертированного конфокального лазерного сканирующего микроскопа, LSM-Pascal (Zeiss, Jena, Германия).

Изображения анализировали с помощью программы LSM-510 Image software. В каждом опыте осуществляли анализ не менее 30 нейронов в 4-5 хаотично выбранных полях. В ходе экспериментов оценивали отношение интенсивности флуоресценции цитоплазмы к флуоресценции ядра для каждого нейрона (Mikenberg et.al., 2007).

Иммуноферментный анализ.

Анализ NF-kBp65 в ядерной фракции и цитоплазматической фракции осуществляли с помощью NF-kBp65-ELISA (Biosource) и в соответствии с протоколом, предложенным производителем. Для выделения ядерной и цитоплазматической фракций клетки собирали и промывали холодным PBS, концентрировали клетки центрифугированием. Полученный осадок ресуспензировали в гипотоническом буфере и инкубировали 15 минут на льду, затем добавляли детергент NP40 и центрифугировали при 4⁰С (3000 об/мин, 10 минут). Супернатант, содержащий цитоплазматическую фракцию, замораживали (-80⁰С), а осадок суспензировали в 50 мкл экстракционного буфера в присутствии ингибиторов протеиназ (30 мин) и центрифугировали при 4⁰С (13000 об/мин, 30 мин). Супернатант (ядерная фракция) собирали, замораживали и хранили до измерения при -80⁰С.

Обратная транскрипция (ОТ) и полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Для выделения тотальной РНК использовали набор SV Total RNA Isolation System (Promega) и лизировали 4х10⁶ нейронов на пробу. Этап ДНКазной обработки проводили в процессе выделения на колонке. Для проведения ОТ использовали RevertAid^™ First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas), согласно протоколу фирмы.

ПЦР проводили в конечном объеме 25 мкл, содержащем 2.5 мкл of 10PCR Buffer, 0.5 мкМ каждого праймера, 200 мкМ dNTP, 2,5 mM MgCl₂, 0.5 ед Тaq-полимеразы AmpliTaq Gold (Applied Biosystems) и 2 мкл ДНК-матрицы. В качестве отрицательного контроля использовали аналогичные пробы с эквивалентным количеством РНК, не прошедшей ОТ. ПЦР проводили в следующем режиме: исходная денатурация матрицы – 95°С, 15 мин.; денатурация – 94°С, 30 сек; отжиг праймеров – 64°С, 30 сек; элонгация – 72°С, 30 сек, заключительная достройка продуктов реакции – 72°С, 10 мин. Реакцию проводили в течение 40 циклов.

Для качественной оценки уровня экспрессии исследуемых генов использовали сравнение с уровнем экспрессии двух референсных генов: глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAPDH) и гидроксиметилбилан-синтазы (Hmbs). Выбор праймеров для ПЦР проводили на основании данных GeneBank. Последовательности использовавшихся праймеров в направлении 5’ – 3’ (прямой/обратный) и длины продуктов (в квадратных скобках) приведены ниже: Gapdh (NM_017008): TGCCATCAACGACCCCTTCA/ ACTCAGCACCAGCATCACCC [189]; Hmbs (NM_013168) CCATCTGCAAACGGGAAAACC/TGAGGGAACTTTCTCTGTAGCTG [145]; Par1 (F2r) (NM_012950): AGCCTGTGCGGTCCTTTG/GGGGGTTTGGCGTAGCAT [94]; Par2 (F2rl1) (NM_053897):GAAGTCTCAGCCTGGCGT/GCGTGTCCAATCTGCCAATCA [129]; Par3 (F2rl2) (NM_053313): GCACACTTAGTGACATCCCATAAC/ GTTGCCATTAAAACTCTCAGCAG [163]; Par4 (F2rl3) (NM_053808): CTCGGGTTCAGCATCAGC/ GGGGACTTCGACTCATTAAGTTCTA [125]; Epcr (Procr) (NM_001025733) TGTGGCTGTGAATGGAAGTG/ CATCAGGATACCCAGGACCA [256]. Синтез праймеров осуществлен ЗАО «Синтол» (Москва). Визуализацию продукта ПЦР проводили методом электрофореза в 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, при напряжении поля 10 В/см.

Статистическую обработку данных проводили в парных выборках, используя t-критерий Стьюдента (GraphPads Prism). Для анализа использовали данные 4-6 независимых экспериментов. Различия считали достоверными при р<0,05, n – число независимых экспериментов.

результаты исследования и их обсуждение

1. Влияние протеиназ гемостаза - тромбина, фактора Xa и АРС, на выживаемость культивируемых нейронов в норме и при эксайтотоксичности, вызванной глутаматом.

Известно, что в условиях острой фокальной ишемии мозга наблюдается выброс возбуждающих аминокислот из ишемизированных нейронов. Основным нейромедиатором, вызывающим эксайтотоксичность в тканях мозга, является глутамат. Глутаматная эксайтотоксичность развивается в течение первых суток после инсульта, приводя к формированию инфаркта мозга. Вместе с тем, процессы, запущенные высокими концентрациями внеклеточного глутамата в первые 3-6 часов после повреждения, индуцируют отдалённые последствия ишемии, вызывая экспрессию генов, кодирующих регуляторы клеточных процессов отсроченной гибели нейронов.

Р
ис.1. Влияние тромбина на гибель нейронов в норме (А) и при токсическом действии глутамата на клетки (Б). Гибель оценивали через 24 часа после воздействия по уровню высвобождения лактатдегидрогеназы из клеток: * р<0.05 по сравнению с глутаматом, здесь и далее n=5-7 независимых экспериментов.