ВКР: Исследование процессов комплексообразования в системе белок-наномаркер

Введение
Методы флуоресцентной спектроскопии с применением флуоресцентных наномаркеров (зондов и меток) с каждым годом всё активнее применяются в лабораторных исследованиях и используются в физике, химии, биологии. На основе этих методов можно распознавать молекулы и различные вещества, получать качественные и количественные характеристики. Одной из важных составляющих этих методов является получение результатов за минимальные сроки без инвазивного воздействия. В частности, с помощью этих методов исследуется строение бычьего сывороточного альбумина, как нативных молекул, так и претерпевших химическую модификацию вследствие внешних воздействий. Методы хороши и тем, что позволяют получать точные результаты при небольших количествах биологического объекта. Белки формируют класс биомолекул, которые играют важную роль в процессах метаболизма и служат индикатором соматических изменений. Бычий сывороточный альбумин представляет собой глобулярный белок плазмы крови (молекулярная масса 64 кДа, изоэлектрическая точка pI 4,9). Его концентрация в плазме и сыворотке (35-55 мг/мл) выше, чем концентрация других белков. Молекулы бычьего сывороточного альбумина состоят из 582 аминокислотных остатков. Третичная структура бычьего сывороточного альбумина определяется тремя доменами, каждый из которых, в свою очередь, подразделяется на два под-домена. В лабораторных исследованиях бычий сывороточный альбумин применяется в качестве стандарта в различных методах количественного определения белков, а также является удобной моделью для изучения свойств глобулярных белков в целом. Именно альбумин вносит основной вклад во внутрисосудистое коллоидно-осмотическое давление, регулирует вместе с другими белками плазмы pH крови, а также является молекулой-переносчиком биологически
важных веществ. Уникальная способность молекулы сывороточного альбумина связывать обширный круг лигандов определяет одну из основных и наиболее важных функций этого белка – транспорт физиологических метаболитов. Механизм связывания лигандов с молекулой сывороточного альбумина определяется наличием на белке специфических участков – связывающих центров. Некоторые реакции связывания обеспечиваются электростатическим взаимодействием, другие – носят ковалентный характер, вызывая химические модификации боковых цепей аминокислотных остатков. К классическим флуоресцентным наномаркерам семейства флуоресцеина относятся – исходное соединение флуоресцеин и его галогенпроизводные: тетра-йод-производная флуоресцеина – эритрозин, тетра-хлортетра-йод-производная флуоресцеина – бенгальский розовый, а также тетрабром-производная флуоресцеина – эозин, который используется в данной работе. Люминесцентные зонды (наномаркеры) чрезвычайно чувствительны даже к незначительным изменениям окружающей их сложной системы, будь то живая клетка или буферный раствор с белком. Задачей флуоресцентной спектроскопии является анализ подобных сигналов, изменений и трансформаций. Для исследования структурно – динамического состояния белковых молекул широко используется флуоресцентные наномаркеры. Наномаркеры семейства флуоресцеина в настоящее время используются для исследования связывающих центров сывороточного альбумина, их физикохимических и структурных свойств с целью моделирования с помощью этих наномаркеров связывания с альбумином ряда лекарственных препаратов для анализа их фармакинетики. Поэтому представляет интерес исследовать собственные флуоресцентные характеристики наномаркера эозина в растворах бычьего сывороточного альбумина, что и являлось целью настоящей дипломной работы.

Глава 1. Флуоресцентная и абсорбционная спектроскопия наномаркеров (зондов) в исследованиях структуры и свойств белков (литературный обзор)
§1.1. Физические основы электронной спектроскопии: спектры поглощения и спектры флуоресценции
Флуоресценция – излучательный переход из возбужденного состояния с синглетного уровня S1 в основное состояние S0: S1 ‒› S0 + hνфл. Такие переходы квантово-механически разрешены, а типичные величины скоростей испускания для них ~ 108 с -1 . Высокие значения скоростей испускания приводят к временам затухания флуоресценции ~ 10-8 с. Время жизни – это средний период времени, в течении которого флуорофор находится в возбуждённом состоянии. Наряду с фосфоресценцией, флуоресценция является видом люминесценции, классифицированной по продолжительности процесса излучения. В этом смысле флуоресценция - более быстрый процесс. Флуоресцентные спектральные данные обычно представляют в виде спектров испускания. Спектр испускания флуоресценции – это зависимость интенсивности флуоресценции от длин волн (в нанометрах) или волновых чисел (в см-1 ). Спектры флуоресценции сильно изменяются и зависят как от химической структуры флуорофора, так и от растворителя, в котором флуорофор растворён. Поглощение и испускание света хорошо иллюстрирует диаграмма уровней энергии, предложенная Яблонским. Основное, первое и второе электронные состояния обозначают S0, S1 и S2 соответственно. Каждый из этих уровней энергии может состоять из множества колебательных энергетических уровней, обозначаемых 0, 1, 2 и т.д. Переходы между различными электронными уровнями обозначены вертикальными линиями.