Фогель, Мотульски - Генетика человека - 2 (947312), страница 74
Текст из файла (страница 74)
Мутации для тестерной линии выбираются таким образом, чтобы 232 б. Мутации О Гомозигоге по мухе нтному гену Э Гегеразигоге по мугенгпому гену ~Я Обпученный самец Рве. 5.49. Принцип метода множественных рецессненых муэаций. Самца дикого типа (ввсргу свсва) облучают и скрсщпяают с самкой нэ гесгерпой линии (ввергл справа). Если индукции мутаций пе пронсходпг, потомсгно будет гегероэпготным по гесгерным покусам н, следовательно, будет иметь нормальный (лпкпй) фепогпп (ваиэу с:гсва). Гели один пз сперматозоидов в одном нз семи покусов несет пндуцироеанную мутацию, одно яз животныхпотомкоа окажется гомознготным по ээому покусу и будет нмеэь мутангный фенотип.
каждую г омозиготу можно было легко идентифицировать. В качестве примера на рис. 5.50 приводится фотография гомозиготы по одному из этих генов (гену пегости). Оба метода, использовавшиеся для скрининга генных мутаций,— метод скелез.- Рве. б.бй. Мышь, нмсющая мутантный феногнп по одному из сечи тестируемых покусов (песость), вместе со своим отцом дикого ных мутапий и метод мнохсественных локусов-позволяют проводить анализ действия генов на уровне количественных феногипических признаков (разд. 3.б). Следовательно результаты, важные для количественной оценки генетических эффектов у млекопитающих, не подходят для анализа механизмов индукции мутаций.
Кроме того, они дают информацию только об ограниченном числе генных покусов. Однако один из результатов этой работы свидетельствует о том, что частоты мутаций, индуцированных в разных генах, могут обнаруживать значительные различия. С появлением электрофоретических методов анализа белков. предпринималось большое число попыток применить их для тестирования на мутагенность. С теоретической точки зрения этот подход безупречен. С его помощью можно проводить идентификацию индуцированных мутаций на молекулярном уровне. причем в настоящее время имеются электрофоретические методики для очень многих локусов (разд. 6.1.2).
Трудность, с которой встречаегся исследователь, применяя этот подход. на практике заключается в том, что он требует проведения большого числа соответствующих анализов, Наши, возможно типа, матерью нз гссэерной линии (ос,гая) и гегерозпгогцымн спбсамн дикого типа. (СопгГсзу о( Пг. (3. Нгйпй. (чецйегЬегй) б Мутации 233 ° Ф неточные, оценки частот кодонных мутаций дают величины порядка 10 " 10 в на кодов или на аминокнслотную замену (разд. 5.1.4.1).
Даже если бы частота спонтанных мутаций, выявляемых электрофоретическими методами, на ~ен составляла 10 ь-1О ~, для обнаружения очень небольшого числа мутантов потребовалось бы громадное количество тест-анализов. Э~у проблему можно назвать ключевой Рве. 5.51. )(вумервое эяектрофоретическое разделение растворимых белков вэ печени плода мьцци; часть белкового спектра. Электрофорезу цодвергвяв пробу белков суцернвтвцтв после гомогеввзвцив и цецтрифугвроввция индивидуальной печени. Разделение белков проводилось в цолнвкрялвмидвом геле посредством взоэлектрического фокусирования (ИЭФ) в одном направлении и электрофореэв (НЛГЭ) во втором.
А. Часть белкового спектра печени плода после обрвбоэкв самца мутвгецом (метвлвитрозомочевицой) Необычное белковое пятно отмечено стрелкой. Ь' Нормальный белковый спектр иечевв плода из той же самой ввбредцой линии мышей. (Соцг!еву о( (Эг В К!озе, Вегйв.) при создании методик скринирования человеческих популяций на увеличение частоты мутаций. Сушествует лн какой- нибудь способ преодоления этой трудности в экспериментах на животных, кроме приобретения громоздкого и дорогостоящего оборудования для проведения тест-анализов? Перспективный метод для подобных экспериментальных исследований — двумерное разделение белков с электрофокусированием в одном направлении н электрофорезом в другом, к которому мы вернемся в разд.
6.1.2 [15161. Высокостабнльные спектры, состоящие из нескольких сотен белковых пятен, можно получить, используя экстракты печени инбредных мышей. Точковая мутация может приводить к легко-обнаруживаемому сдвигу одного «пятна» (рис. 5.51). Насколько нам известно, при проведении радиационных экспериментов этот метод еще не применялся. Тест-системы дяя со.иатических мутаций. Для выявления соматических мутаций используют анализ хромосом в культурах лимфоцитов или в костном мозге. Лимфоцитарная система довольно часто применяется в исследованиях на человеке. Это действительно единственная система, позволяющая изучать группы людей, подверженных высокому риску, прн минимальных отрицательных последствиях от генетических эффектов, вызванных воздействием мутагснных факторов.
Еще более простая тест-система основана на анализе хромосом, облученных (и ч!(го. При тадом тестировании в большинстве случаев использовались культуры лнмфоцнтов человека. Именно па этой системе было показано, что общие правила индукции мутаций, сформулированные в экспериментальной генетике, применимы и к хромосомам человека (разд. 5.2.1.1). Для некоторых биохимических маркеров разработаны методы выявления точковых мутаций в отдельных клетках, культивируемых !и чпго (разд. 5.1.5). Этот метод может быть использован для тестирования на мутагенность.
С теоретической точки зрения он представляется очень изящным. 234 б. Мутации Его разрешающая способность на несколько порядков выше разрешающей способности методов обнаружения генных мутаций ш угко, так как в данном случае объектом !единицей) экспериментального изучения является не особь, а отдельная клетка. Кроме того, мутанты можно клонировать и подвергать всевозможным биохимическим исследованиям. Однако на практике этот метод пока встречается с определенными трудностями. Так, например, селективные системы созданы только длв очень небольшого числа биохимических маркеров; некоторые вариантные клетки могут возникать не в результате мутаций, а по каким-то иным причинам; экстраполяция же величин, полученных длв очень искусственных условий эксперимента !и уйго на ткани живого организма, всегда представляет трудную задачу. 5.2.1.3.
Результаты изучения мутагсянога действия радииции па млекопитающих "!13773 Оспавкью эффекты, вызванные воздействием радиации па половые клетки млекопитающих. Развитие половых клеток у людей обоего пола описано в разд. 5.!.3, В принципе оно сходно с таковым у всех млекопитающих; небольшие межвидовые различия имеют важное значение для планирования экспериментов по изучению мугагенеэа, ио здесь рассматриваться ие будут. У мышей наблюдались следующие основные эффекты воздействия радиации на развитие половых клеток.
Острое облучение мужских половых клеток 2 — 4 Гр убивает большинство сперматогониев, в то время как более зрелые половые клетки (сперматоциты и клетки, находящиеся на всех постмейотических стадиях) выживают. Следовательно, в течение первых шее~и недель после облучения происходит небольшое понижение фертильиости. На протяжении этого периода все половые клетки, уже достигшие стадии сперыатоцита, превратятся в зрелые сперматозоиды.
За ннм следует период бесплодия продолхсительиостью 2 — 3 месяца в зависимости от дозы радиации. По прошествии этого периода плодовитость восстанавливается. При этом семенные канальны снова заполняются клетками, популяция которых берст начало от очень небольшого количества сперматогониев А. Самки даже прн низких дозах облучения после короткого лат-периода становятся навсегда стерильными. При облучении ренэ геновскими лучами дозой 5 Гр самки мышей приносят до нас гуплеиия бесплодия, обусловленного разрушением ооцнтов, трнчстыре помета.
При приближении к овуляцин ооциты становятся более устойчивыми, и непосредственно перед овуляцпей частота их гибели не отличается от контрольной. Высокая чувствительность ооцитов зазруднкет проведение экспериментов по мутагенезу Эги различил в радиационной чувствительности половых клеток у особей разного пола и на разных стадиях развития следует иметь в виду при рассмотрении результатов экспериментов, посвященных изучению мутагенности такого фактора, как радиация. Хромасомные мутации в мужских и женских половых клетках мышей !"!4541.
При просмотре митотических пластинок сперматогониев после острого облучения обнаруживается высокая частота хромосомных аберраций (разрывов, фигур воссоединения, дицентрических хромосом), Такие аберрации можно выявить, изучая первые деления мейоза, Имеются аналогичные экспериментальные данные, полученные на мужчинах 114013". Материал для исследования был взят путем биопсии семенников у девяти мужчин-добровольцев, половые железы которых были облучены высокими дозами рентгеновских лучей (0,78, 2 и 6 Гр).
Интервал между облучением и взятием проб изменялся в зависимости от дозы. Для сравнения проводилось облучение сходными дозами и при сопоставимых условиях самцов животных различных других видов (табл. 5.25). Дозы, применявшиеся в этих исследованиях, варьировали от 100 до 600 рад. Наибольшее увеличение выхода реципрокных транслокаций с увеличением дозы радиации было у мармозеток, а второе по величине — у " Использование людей для таких экспериментов нам кажетсх совершенно недопустимым. Исследователи утверждали, что они работали только с теми заключениыми-добровольцами, которые не планировали в будущем иметь детей.
Однако такие планы могут изменитьсн, и, кроме того, существует возможный риск канцерогенного эффекта этой процедуры. б. Мутации 235 ! яб.ипш 5.25. Сравнение коэффициентов линей- ной регрессии «Ь» вычисленных для различных видов млекопитающих при индукции репипрок- аых трвислакапий в сперматпгоииях Ь 10 Яйп/!О Животное Макак-резус Мышь (рдзные линии) 0,86 Ч- 0,04 между 1,29 + 0,02 и 2,90+ 0,34 1,48 ч- 0,13 0,91 -1- 0,18 7,44 х 0,95 3,40 Ч- 0,72 Кролик Морская свинка Мармозетка Человек Кпэффипи«иты линейной регрессии (Ь) лля всех видов вычисляли с исппльзпвлиием данных, пелучслггых рядом авторов при дозах, Лающих наибольший выхпл трвислоклпий Прямое доказательства волн гкнавения пндуцнрггваннмх хромосомны аберрггций.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
