Крутецкая, Лебедев, Курилова - Механизмы внутриклеточной сигнализации - 2003 (947291), страница 30
Текст из файла (страница 30)
ззв В ряде работ обнаружено также, что активация 1„,„„вызываемая агонистами или )Рз, является высоко нелинейным процессом, происходящим в узкой области концентраций. Это свидетельствует о том, что активация 1„„. являезся, по-видимому, процессом, работыощим по принципу "все или ничего" (Рагейй ег а1., 1997; Нпапб, Рпгпеу, ! 998).
В последнее время разработаны методы одновременной регистрации активности огас-каналов (в режиме пэзч-кламп в конфигурации"зчбо1е се1Р) и концентрации Са в ЭР с помощью зонда Май-Рцга 2-АМ (НоГег е! а1., 1998). Обнаружено, что с помощью нового проникающего через мембрану Са '-хелатора )Ч, И, М, )чьтетраки (2- пиридилмегил) этилендиамина [ТРЕ)')) можно фиксировать концентрацию Са ' в депо на любом заданном уровне в течение 10-15 с, не влияя на активность Са '-насосов или каналов Са"-выброса. Показано, что: 1) 1„.,„активируется исключительно при уменьшении концентрации свободного Са" в депо; 2) амплитуда !„коррелирует со степенью опустошения депо: 3) не существуег порога опустошения депо дзя активации 1„.
Более того, обнаружено, что кинетика инактивации 1„,„, относительно медленная и зависит, по-видимому, от растворимых факторов, которые теряются при работе в режиме "зло)е сей". По мнению авторов, с гсутствие порога активации и медленная скорость инактивации 1„„не согласуются с моделями, предполагающими белок-белковые взаимодействия, и свидетельствукп о существовании относительно мелленного метабояического этапа, спветственного за включение и выключение емкостного входа Са (НоГег е! а1.. 1998). Основным Са '-связывающим белком во внутриклегочных лепо невозбудимых клеток является кальретикулин. При экспрессии кальретикулина в 1. фибробластах наблюдается увеличение содержания Са' в тапсигаргни-чувствительных Са -депо и существенное подавление депо-зависимого ахола Са ', вызванного тапсигаргином (Мегу ег а1., ! 996).
Прелполагают, чзо кальретикулин активно участвуег в регуляции емкостного входа Са в клетки. В плазматической мембране клеток эпидермоидной карциномы А43! (К)зе1уот е! а1., 1997И и перитонеальных макрофагов мыши (К)ае1уоч е! а!., 1997а; Семенова и др., !998) идентифицированы Са '- каналы, прямо активируемые ! Рз. Авторы назвали эти каналы 1,„„ (пз)п)а!цге Са с!залпе!в). Каналы имеют очень низкую проводимость (1 пСм), высокую селективность для Са относительно К (Р» ~рк>!000); вероятность их открытого состояния возрастаег при гнперпг!ляризации мембраны. Указанные свойства отличают эти каналы от ! Рз— активируемых каналов ЭР, но позволякп отнести их к семейс"гву сгасканалов. С другой стороны, !Р,-чувствпзельные каналы в плазматической мембране исследованных клеток имеют свойства, характерные для 1рзрецептора ЭР: дозо-зависимость эффекта 1Рл )Р,-зависимую 139 десенситизацию рецептора, чувствительность к блокирующему действию гепарина и арахндоновой кислоты.
Предполагают, что )Р;-активируемые Са -каналы а плазмач.ической мембране мокнут непосредственно регулироваться 1Р,-рецептором в мембране ЗР. )рз-рецептор связывается с 1Рь изменяет конформацию и передает сигнал с ЗР к высоъоселелтивному Са -каналу в плазматической мембране (Семенова и лр.. 1993). Зта точка зрения согласуется с моделью "конформационного связывания А СОСтОР(НИЕ ПСжОР( (я сД Рис. 40 Модель функционального свнзыванин Са'-канала (1 и) с комплексом 1Рз-рецептор (1РзК) - Р(Р,.
А. В состоянии покоя популяция 1Рсрецепторов, расположенных под плазмалеммой, образует ингнбнзорный комплекс с Р1рз, локализованным в плазматической мембране. Зтн 1Рз-рецепторь! прямо или опосредованно связаны также с Саз'-каналами (1„„) в плазмалемме. В. Стимуляция клеток агонистами вызывает активацию фосфолипазы С (Р1.С), расщепление связи 1р,-рецептор - Р1Рз, образование 1рз и изменение конформации 1Рз-рецептора. Изменение конформации )Рпрецептора приводит к активации Са -каналов (1,„) н входу Сд в клетку (по Каапасйеуета ез а(..
2000). Далее эз и же авторы на клетках А431 показали, что 1,„„, в мембранных фрагментах "(пз!г)е-оц!" действительно регулируется (Рк рецепторами, входящими в состав микросом мозжечка крысы, и блокируется соединением ЯКЕ 95365, ингибируюшим 1 (2пЬоч ег а1.. 1999). Полученные данные свидезельствуют о сходстве между 1,„и сгасканалами и являкпся веским аргументом а пользу модели "конформационного связывания". На мембранных фрагментах "(пзЫе-оц1" клеток А431 обнаружено также, что активность!,„существенно возрастает в присутствии антитела к Р!Рз и уменьшается при добавлении Р!Рз (Кагпасйеуета е! а!., 2000).
Предполагают, что активация 1„„, в клетках А431 происходит путем их прямого конформационного связывания с определенной поптляцней (Р,- рецепторов, расположенных под плазматнческой мембраной, и связанных с Р1Рз (рис. 40). В пользу модели "конформационного связывания" свидетельствуют также данные, полученные на клетках линии НЕК 293 с использованием метода пэтч-кламп и молекулярно-биологических методов (К(эе(уст е( а1., 1998). Авторы экспрессировали в клетках НЕК 293 Нзгр З-белки, образующие депо-зависимые Са" -каналы (УЬц е! а1., 199б).
Показано, что Н1гр 3-каналы находятся в тесном функциональном взаимодействии с (Рзрецепторвми. Но.р 3-каналы активируются Са '-мобилизующими агонистами в интактпых клетках или прило>кением (рз к мембранным фрагментам "(пьзбе-оцг" Активируюшее влияние (Р, на Нггр 3-каналы блокируется гепарином или проникающим через мембрану ннгибитором 1Р,-рецепторов ксестоспоигином С. Обнаружено также. что активирующее действие !Р, на Нггр 3-каналы исчезает при длительном отмывании мембранных фрагментов, но может быть восстановлено при добавлении нативньш или рекомбинантных!Рз-рецепторов, связанных с !Рз. Полученные данные свидетельствуют в пользу модели конформационного связывания, в соответствии с которой 1Р;-рецепторы, активированные 1Рз, взаимодействуют с дево-зависимыми Са -каналами (К(зе)уоч е! а1..
1998). В последующей работе эти авторы показали, что для активации Н(гр 3-каналов важен Ы-терминальный (1Рпсвязыввющий) домен 1Р,-рецептора (К(эс!уст ег а1., 1999). 5.32.4. Молекулярная природа депо-зависимых Са -каналов 2+ До настоящего времени сгас-каналы все еще не клонированы и ничего не известно о структурных компонептах каны!а, агвечаюшнх за селективность и воротные функции. Исследование механизмов перелачи сигналов в фозорешппорах ()гозорЬ(1а позволило предположить, что белок, копируемый геном !гр„ может являться компоненюм депо-зависимого Са '-канала, зз! активируемого при опустошении Са -депо, вызванном световым сшмулам (11аггйе, М!п(ге, 1992, 1993). Меюдами молекулярного клонирования показано, что !гр-канат имеет поразительное сходство по аминокнслотной последовательности с потенциал-зависимыми Са каналами (РЬ!(йрв е! а1., 1992).
Тгр-канал представляет собой белок из 1275 алгннокислот, включаез. шесть трансмембраннх сегментов (51-56) и соответствует одному гомологичному домену гц-субьединицы погенциалзависимых Са'-каналов 1.-типа (рис. 41). Сегменты 53-56 и участок 551- 552, соединяющий сегменты 55 и 56 и участвующий в образовании поры ггр-канала, в высокой степени гомологичны таковым позепциалзависимых Са -каналов. Однако се~мент 54, выполняющий функшпо сенсора напряжения в потенциал-зависимых каншщх (Н!!!е„1992; Мог! е! а(., 1996; Н!Не, 2001), в ггр-канале не содержи~ положительно заряженных аминокислот. Тгр-белок содержит длинный, богатый пролином С- терминальный фрагмент. Предполагают.
чза уникальный богатый пралином участок на гидрофильном С-конце молекулы может взаимодействовать с 1рз-рецептором (3!аса е! а(., !994). Кроме того, обнарукено, что этот богатый пролином участок может обеспечивать чувжгвитсльиость к тапсигаргнну (5(п(л(пз е! а!., 1996). Гомологи ггр-каналов идентифицированы в тканях человека ()тез е! а1., 1995; Лш е! а!., 1995, !996), мыши (Регегзеп е! а!.. 1995) н ооцитах Хепорвв (Ре!егзеп е! а(., !995). Предполагают, что гомолоп! (гр-канала могут являться субъединицамн депо-зависимых Са" -каналов у позвоночных животных (Наг!()е, М!п)ге, 1993; Вегпдйе, 1995а; Регегзеп е! а(., 1995; В!гпЬаоглег е! а1., 1996; Рпе!, 1996; Лш е! а1., 1996).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
