Лекция. Бактериофаги (831472), страница 2
Текст из файла (страница 2)
При избытке фагав окружающей среде на одной клетке может адсорбироваться до 200–300 вирусныхчастиц.• В случае Т4 и подобных энтеробактериальных фагов после необратимой адсорбциив чехле отростка высвобождаются ионы Са2+, активирующие АТФазу, что вызываетсокращение чехла, проталкивание стержня отростка сквозь внешнюю мембранубактерии, локальное растворение лизоцимом пептидогликана (муреина)и инъецирование в клетку ДНК вириона.
С момента попадания фаговойнуклеиновой кислоты в бактериальную клетку и до полного созревания в нейвирусных частиц проходит определенный отрезок времени,называемый латентным. Он уникален для каждой системы «бактерия — фаг»и может составлять от нескольких минут до нескольких часов.• Введенная ДНК фага вызывает полную перестройку метаболизма бактерии: прекращаетсясинтез ее собственных ДНК, РНК и белков. ДНК бактериофага может начинатьтранскрибироваться его же РНК-полимеразой — например, фаг N4 впрыскивает этотфермент вместе с ДНК.
Или же, как в случае Т4, фаг впрыскивает фермент АДФрибозилтрансферазу (продукт гена alt), модифицирующий хозяйскую РНК-полимеразу так,что та переключается на транскрипцию исключительно фаговых генов.• Синтезирующиеся мРНК поступают на рибосомы бактерии, которые послушно производятбелки бактериофага: ранние (ДНК-полимеразу, нуклеазы) и поздние (белки капсида,отростка, базальной пластинки и др.). Репликация ДНК бактериофага осуществляется егособственной ДНК-полимеразой.
Поздние белки и копии фаговой ДНК объединяются,образуя зрелые инфекционные фаговые частицы.• Затем происходит лизис клетки-хозяина: фаговые лизины (гидролазы, а не аминокислоты!)и холины изнутри пробивают отверстия в ее мембране и пептидогликане, и в клеткуначинает поступать вода. В итоге бактерия лопается с выходом зрелых бактериофагов(рис. 10). При этом в зависимости от типа фага количество образовавшихся вирионов будетразличным — от единичных частиц до нескольких тысяч.(2) Умеренные фаги проникают в клетку также, как и вирулентные.
Например, фаг Muинъецирует генетический материал очень схоже с Т4, но базальная пластинка Muустроена проще, и гомологи ее компонентов обнаружены в инъекционных аппаратахбольшинства фагов с сократимым чехлом. Более того, подобные компонентыхарактерны и для бактериальных наномашин вроде системы секреции VI типа и Rтейлоцинов (рис. 11).Умеренный фаг инициирует лизогенный цикл, при котором он вместо репликацииобратимо взаимодействует с геномом бактерии-хозяина, интегрируясь в хромосому(фаг λ), либо поддерживается в клетке в виде низкокопийной плазмиды (фагиP1 и N15).
В первом случае ДНК фага пассивно реплицируется в составе хромосомы.Так или иначе при делении бактерии фаговый геном передается дочерним клеткам.Такое состояние фага называется профагом, в нём вирус может находиться во многихпоколениях потомства первой зараженной им клетки. Бактерия, содержащая профаг,лизогенна до тех пор, пока при определенных условиях профаг не активируетсяи не вступит в литический цикл.
Переход от лизогении к лизисуназывается лизогенной индукцией, или индукцией профага. На индукцию фагаоказывают влияние условия внешней среды, состояние клетки хозяина, наличиепитательных веществ и т.д.• Но некоторые фаги способны покидать клетку без лишнего шума.Так делает, например, фаг L2, паразитирующий в бактерияхрода Acholeplasma, лишенных клеточной стенки (их знаменитыеродственники — микоплазмы). Вначале он проходит все стадии,соответствующие определению «литический цикл» —но за исключением собственно лизиса хозяина: вирионы как быотпочковываются от бактерии, захватывая небольшие участкиее мембраны, которые становятся оболочкой фага.
После такогоделикатного литического цикла L2 может приступитьк лизогенизации.Получение бактериофагов• Бактериофаги широко распространены в природе. Везде, где естьбактерии — есть фаги. Их можно выделить из открытых полостейорганизма человека и животных, водоемов, сточных вод, почвы,из соответствующих культур бактерий и т.д.
Большое количествобактериофагов находится в выделениях больных людейи животных, особенно в период выздоровления от инфекционныхзаболеваний.• Таким образом, поиск и выделение новых фагов не представляет трудности. Длявыделения бактериофага исследуемый материал (воду, испражнения, гной, почвуи др.) засевают в жидкую питательную среду, инкубируют в термостате, и черезсутки помутневшую жидкость пропускают через бумажный, а затем черезбактериальный фильтры, асбестовые пластины, керамические свечи. Полученныйфильтрат исследуют на наличие бактериофага путем совместного посевас подходящей микробной культурой на плотные или в жидкие питательные среды.Если бактериофаг выделился, то после 18-часовой инкубации на поверхности агаравырастает сплошной газон культуры с прозрачными бляшками — зонами лизиса(рис.
12). В бульоне бактериофаг обусловливает просветление среды.• Для выделения чистой культуры бактериофага материал из отдельной бляшкипереносят бактериологической иглой в суспензию молодой микробной культуры.• Материал из вновь возникшего стерильного пятна засевают вместес фагочувствительными микробами в жидкую питательную среду. После 6–18 часовинкубации среду фильтруют и получают чистую культуру бактериофага.• Для изготовления серийного препарата бактериофага применяют только апробированные штаммыи культуры микробов, обладающие типичными морфологическими, биохимическимии серологическими свойствами. Штаммы бактериофагов должны быть музейными и рабочими.Музейные производственные штаммы ежегодно обновляются путем выделения новых или пассажамиимеющихся фаговых штаммов через организм больного, а также адаптацией к свежевыделенным,резистентным к данному бактериофагу культурам.• Промышленное получение бактериофага в настоящее время осуществляют в специальныхаппаратах — реакторах емкостью 250–1000 л, с применением аэрации как фактора, стимулирующегоразвитие микроорганизмов.
В реактор наливают жидкую питательную среду, которую стерилизуютпри температуре 110 °С в течение 40 минут. После стерилизации среду охлаждают до 39 °С и засеваютсоответствующей микробной культурой и бактериофагом одновременно. Для засева используют 18часовые агаровые культуры, которые прибавляют из расчета 50 млн микробных клеток на миллилитрсреды.
Бактериофаг добавляют в количестве не более 0,3 % по отношению к объему питательнойсреды. Среду с бактериальной культурой и фагом оставляют при температуре 37 °С на 6–18 часов.Фаги активно размножаются внутри бактериальных клеток и вызывают их лизис, что внешнепроявляется полным просветлением среды. К полученному лизату добавляют в качестве консервантахинозол (0,01 %) или фенол (0,25 %) и не позже чем через два часа после этого фильтруют содержимоереактора через бактериальные фильтры для удаления оставшихся микробных клеток.• Полученный препарат бактериофага должен иметь вид совершенно прозрачной жидкости желтогоцвета.
Он проходит контроль на стерильность, безвредность и литическую активность. Безвредностьпрепарата проверяют путем введения животным. Например, брюшнотифозный и дизентерийныйбактериофаги вводят подкожно трем мышам по 1 мл, либо внутривенно одному кролику 5 мл.За животными наблюдают в течение 3–4 суток. Литическую активность бактериофага определяюттитрованием в жидкой питательной среде методом Аппельмана, на плотной питательной среде —методом Отто.
За титр бактериофага при определении методом Аппельмана принимают то егонаибольшее разведение, которое вызывает полный лизис тестовой культуры микроорганизмов.• После проведения контрольных исследований препарат разливают во флаконы нейтрального стекла.Помимо жидких препаратов бактериофага могут изготавливать и сухие. Для их получения фаголизатосаждают сернокислым аммонием, осадок отделяют от жидкой части, добавляют к нему стабилизатор(9 % глюконат кальция), смесь тщательно растирают и лиофилизируют.Биологическое значение бактериофагов• Бактериофаги играют важную роль в круговороте углерода и энергии, контроле численностимикробных популяций и эволюции бактерий.
Бактериофаги, будучи подвижными генетическимиэлементами, служат мощным фактором изменчивости бактерий. Например, они осуществляютпроцесс трансдукции — перенос бактериальных генов из одной клетки в другую: вырезаясь из геномаодной бактерии, они могут прихватывать с собой в капсид ее гены и, инфицируя другую клетку,передавать их новому хозяину. Есть все основания предполагать, что большинство бактерий содержитпрофаги.
Многие культуры несут 2–4 и даже более умеренных фагов, то есть являютсяполилизогенными. Например, многие актиномицеты и клубеньковые бактерии содержат в геномечетырех и более профагов.• Способность фагов менять фенотип бактерий путем привнесения чужеродных (и фаговых в том числе)генов может быть одновременно залогом процветания для бактерий и источником больших проблемдля человечества: так бактерии могут приобретать факторы вирулентности и устойчивости — к другимфагам, антибиотикам и прочим воздействиям (если фаг, например, награждает бактериюспособностью формировать биопленки). В 1951 году была описана фаговая конверсия Corinebacteriumdiphtheriae: оказалось, что ген tox, кодирующий дифтерийный токсин, в геном нетоксигенныхбактериальных штаммов привносится умеренным фагом β.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
