150712 (732809), страница 4

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 4)

Для исследователей липидов, простагландинов, гормонов, углеводов, антибиотиков, витаминов и многих других классов соединений, тритий — главный (часто единственно доступный) инструмент повышения чувствительности методов. Это же касается исследований рецепторов, модуляторов и вообще "сигнальных" систем организмов. Поэтому тритий, не имеющий пока особых альтернатив, по-прежнему, остается основным "рабочим" радионуклидом в life science.

Главным недостатком трития является трудность его детекции и количественного измерения из-за слишком "слабого" β-излучения. Наиболее эффективный способ измерения — жидкостной сцинтилляционый счет, о котором более подробно дана информация в разделе 2.2. Особо следует подчеркнуть, что именно для трития снижение эффективности счета ("гашение") играет существенную роль в количественных измерениях.

Авторадиография тритиевых соединений тоже имеет ряд специфических особенностей. Прямая детекция β-излучения трития фоточувствительным материалом — процесс очень долгий и используется редко. Зато была предложена оригинальная модификация, согласно которой образец, содержащий тритий, обрабатывается сцинтилляционными веществами, и авторадиография превращается в своеобразную "автофлюорографию". Для пластин ТСХ — это опрыскивание раствором РРО, который уже упоминался в разделе "жидкостной сцинтилляционный счет". После высушивания такая пластинка экспонируется с рентгеновской плёнкой, и далее — как обычно.

Для ПААГ предложена процедура пропитки геля тем же РРО. Сначала приходится заместить воду в геле на диметилсульфоксид (DMSO), т.к. РРО нерастворим в воде. Затем гель пропитывают раствором РРО в DMSO, после чего обратно замещают DMSO на воду (РРО выпадает в геле в осадок и гель становиться белым). После всех этих процедур гель высушивают и экспонируют с рентгеновской пленкой. "Занудность" этих операций окупается сторицей — получается возможность детекции продуктов, меченных тритием, (например пептидов, меченных ³Н-лейцином) сразу после электрофореза в ПААГ.

Еще одна "деликатная" сторона использования соединений, меченных тритием, — это химическая стабильность таких соединений. Как ни странно на первый взгляд, но радиолиз — химическое разрушение молекул под действием ионизирующего излучения — именно для соединений трития играет весьма существенную роль. Это важно помнить, т.к. большой период полураспада (12 лет) якобы позволяет использовать синтезированные вещества в течение месяцев ( а иногда и лет) с момента паспортизации. Здесь надо быть очень осторожным, т.к. часто при неправильных условиях хранения вместо целевого соединения остается сложнейшая смесь продуктов радиолиза, где нужного соединения не более трети. Типичная ошибка — хранение водного раствора тритиевого соединения в замороженном виде. В замороженном виде высокомеченные тритием соединения "рассыпаются" гораздо быстрее, чем в растворе. Поэтому для длительного хранения меченых тритием соединений при -20°С обязательно добавляют спирт или другой "антифриз", препятствующий замерзанию раствора.

С химической стабильностью соединений трития связана еще одна проблема. Устойчивость химической связи водорода (любого изотопа водорода) с другими атомами в молекуле зависит от природы этой связи. Соответственно, возможность обмена водорода в молекуле меченого соединения с растворителем, например с водой, обязательно надо учитывать. Водород карбоксильной группы в воде за счет электролитической диссоциации обменивается мгновенно, а водород в алкильном или арильном фрагменте молекулы обменивается очень трудно — при нормальных условиях обмена нет. Между этими "крайними" примерами находится огромное многообразие молекул с разной способностью к "водородному обмену", и для разных биохимических процессов вопрос о стабильности тритиевой метки может быть или чрезвычайно актуальным или совершенно несущественным.

7. Радионуклид ¹⁴C

Радионуклид ¹⁴C получают облучением нитрида алюминия по реакции:

¹⁴N + ⁰n —> ¹⁴C + ¹p

в виде ¹⁴C-карбида. Из него ¹⁴C выделяют в виде ¹⁴CО₂, который обычно поглощают Ba(OH)₂, и полученный ¹⁴C-карбонат является основным радиоактивным сырьем для всех синтезов ¹⁴C-соединений. Всё обилие ¹⁴C-меченых соединений в каталогах разных фирм-производителей синтезируется двумя путями:

1. Биосинтез. В питательную среду к микроорганизмам (обычно это водоросли типа хлореллы) добавляют ¹⁴CО₂ в качестве единственного источника углерода. После выращивания из биомассы выделяют равномерно меченые ¹⁴C-соединения. Таким путем получают аминокислоты, нуклеозиды, сахара, липидные компоненты и другие природные соединения. Иногда ¹⁴C-биомассу водорослей используют как источник углерода (своего рода меченый пептон) для выращивания штамма-продуцента какого-нибудь важного соединений.

2. Химический синтез. Синтез всего многообразия органических веществ из карбоната — классическая задача органической химии. Знаменитые цепочки превращений органических соединений (кошмар многих поколений студентов и школьников) в полной мере реализованы в синтезе ¹⁴C-соединений. Все органические соединения, которые не удается получить биосинтезом, синтезируют химически.

Схема распада углерода-14: ¹⁴C —> ¹⁴N + e. Хотя с детекцией ¹⁴C особых проблем не возникает, применение ¹⁴C-соединений в life science крайне ограничено. Это связано с очень низкой молярной активностью ¹⁴C-соединений, и даже кратно меченые молекулы не меняют ситуацию радикально. Обычно молярная активность ¹⁴C-соединений не превышает 20÷50 мКи/ммоль, (у соединений трития почти в 1000 раз выше, а у фосфора-32 или 33 еще в 100 раз выше) и, следовательно, по чувствительности методы с использованием ¹⁴C-соединений значительно уступают методам, в которых используют ³Н-соединения. На сегодняшний день ¹⁴C-соединения прочно удерживают за собой только одну "нишу" в life science — это изучение метаболизма новых лекарственных (или косметических) препаратов. Для изучения деградации, накопления в органах, скорости и путей выведения, биодоступности и прочих аспектов метаболизма равномерно меченые ¹⁴C-соединения остаются востребованными, несмотря на очень высокую стоимость и трудоемкость синтеза.

8. Радионуклиды ³²P и ³³P

Радионуклиды ³²P и ³³P — очень удобны для life science, но их применение ограничено природой, т.к. фосфор в природных органических соединениях присутствует гораздо реже, чем водород, углерод или кислород.

Получение радиоактивных изотопов фосфора (³²Р и ³³Р) с технической точки зрения одинаково: облучение элементарной серы особой чистоты в ядерном реакторе.

Однако, с экономической точки зрения разница колоссальная. Дело в том, что ³²Р получают по реакции ³²S + ⁰n —> ³²P + ¹p в виде ³²P-ортофосфата. Стартовый материал мишени — природная элементарная сера, содержащая более 92% стабильного изотопа ³²S. Изотоп ³³Р получают по реакции ³³S + ⁰n —> ³³P + ¹p также в виде ³³P-ортофосфата. Но мишенью для этой реакции служит изотоп ³³S, содержание которого в природе составляет доли процента. Для получения ³³Р высокого качества необходимо использовать для облучения только ³³S с обогащением не ниже 98,5÷99,0%. Это сразу существенно увеличивает стоимость продукта, т.к. стоимость обогащенной серы-33 больше природной серы примерно на 6 порядков (в миллион раз). Поэтому соединения фосфора-33 всегда будут дороже аналогичных соединений, меченных фосфором-32.

Схемы распада радионуклидов фосфора : ³²P —> ³²S + e и ³³P —> ³³S + e

Исходным радиоактивным сырьем для получения соединений, меченных радиоактивными изотопами фосфора, всегда является ортофосфорная кислота (³²Р или ³³Р соответственно). Так как химия и биохимия ³²Р и ³³Р абсолютно одинаковы, в дальнейшем речь пойдет о фосфоре-32, с учетом того, что все это распространяется и на фосфор-33. В особых случаях, когда необходимо, будут отмечаться различия. Собственно сама ³²Р-орто-фосфорная кислота в life science используется редко. Обычно это выращивание микроорганизмов (бактерий или дрожжей) или культуры клеток в среде, содержащей ³²Р-ортофосфат. Полученную меченую биомассу отделяют от культуральной жидкости, а затем исследуют. Несколько замечаний по этому процессу.

1. Исходная ³²Р-ортофосфорная кислота без носителя (этот термин означает, что в препарат не добавляли специально нерадиоактивную ортофосфорную кислоту) имеет молярную активность не менее 5000 Ки/ммоль, и, соответственно, концентрация собственно фосфата в среде только за счет радиоактивного фосфора будет не выше 10^-8 М. Для биологических (микробиологических) работ такая концентрация фосфата в среде слишком низкая — клетки будут "считать", что фосфора нет вообще. Поэтому в культуральную среду обязательно добавляется "холодный" фосфат в концентрации, необходимой для усваивания. Обычно это не ниже 10^-4 М. Не пытайтесь "включить" радиоактивный фосфат в культуру клеток без "холодного" носителя. Часть радиоактивного фосфата просто сорбируется на поверхности посуды или клеток, а включения в клеточный обмен не произойдет.

2. Оптимальная концентрация фосфата для таких экспериментов подбирается индивидуально для разных задач и видов клеток. "Переносить" данные по оптимальной концентрации с одного вида экспериментов (или клеток) на другой надо осторожно.

Основными соединениями фосфора-32, применяемыми в life science, являются нуклеозид-5'-трифосфаты, меченные в альфа или гамма положении. В конце 60-х — начале 80-х годов ХХ века было разработано несколько способов синтеза этих соединений, но после работы Джонсона и Валсеса, предложенный ими ферментативный способ стал рутиной как для лабораторного синтеза, так и для масштабного производства. Химические методы синтеза меченных фосфором-32 соединений используются, когда нет ферментативного пути, например для синтеза синтетических аналогов нуклеотидов.

Измерение активности радионуклидов ³²Р и ³³Р — операция достаточно простая — любой жидкостной сцинтилляционный β-счетчик считает ³²Р и ³³Р с эффективностью не ниже 90%. Для фосфора-32 использование сцинтиллятора совсем не обязательно. Обычно измерение фосфора-32 проводят за счет "свечения Черенкова" — эффекта, обусловленного взаимодействием высокоэнергетических электронов с окружающей средой. Не вдаваясь в физические аспекты Черенковского свечения, следует знать, что сцинтилляционные счетчики "считают" фосфор-32 без всякого сцинтиллятора с эффективностью около 30%. Черенковское свечение фосфора-32 можно легко увидеть. Нанесите на подложку (пластинку ТСХ или фильтровальную бумагу) 1 мкл раствора ³²Р-ортофосфорной кислоты (или любого другого соединения фосфора-32) с активностью 50 мкКи (около 2МБк) и поместите подложку между плоскостями двух кусков обычного стекла, толщиной 4÷5 мм. В темноте (только без "красного" света) через 3÷5 мин. адаптации глаза будет хорошо видно зеленовато-голубое свечение пятна, соответствующего точке нанесения раствора на подложку. Не подносите такой источник близко к глазам — все прекрасно видно с расстояния 40÷60 см.

Весьма полезным для работы является возможность измерения фосфора-32 прямо в пластиковых пробирках, помещенных в стандартный сцинтилляционный флакон. На практике это означает, что вы можете измерять активность своего образца, например, вырезанный кусок из агарозного геля или пробирку с фракцией элюата хроматографического разделения, а затем использовать образец для дальнейшей работы. Такая особенность фосфора-32 является его важнейшим преимуществом перед другими β-радионуклидами, применяемыми в life science. Все остальные β-радионуклиды, приведенные выше в таблице 1, включая фосфор-33, требуют для измерения в сцинтилляционном счетчике прямого контакта с сцинтилляционной жидкостью, т.е. добавления образца прямо во флакон, содержащий сцинтиллятор. Естественно, после этого образец для дальнейшей работы теряется.

Среди радионуклидов, применяемых в life science, фосфор-32 является "рекордсменом" по чувствительности методик с его использованием. Однако, простой расчет чувствительности метода (поделите обычный предел обнаружения фосфора-32, т.е. около 3÷4 Бк, на максимальную молярную активность используемого соединения, т.е. около 2х10¹⁷ Бк/моль) показывает величину около 10^-17 моля. К сожалению, это неправильно. Причина этого в высоком "биологическом" фоне. Например, при постановке ДНК-полимеразной реакции контрольная проба, в которую добавляют все компоненты реакции кроме фермента, также показывает некоторое "включение" радиоактивного фосфора в ДНК, на самом деле обусловленное просто неспецифической сорбцией радиоактивного предшественника биосинтеза. Такая неспецифическая сорбция есть всегда в любом биохимическом эксперименте и фактически чувствительность метода будет определяться величиной этого "биологического" фона. Например, в реакцию добавлено 0,1 МБк [α-³²P] dNТР (это примерно 2х10⁶ срм по Черенкову), ферментативое включение в ДНК около 30%, а неспецифическая сорбция — фон — составляет около 0,1%, т.е. 2х10³ срм. Граница достоверности определяемой величины будет определяться именно неспецифической сорбцией (в этом примере 2х10³ срм), которая обычно гораздо выше фона измерительной аппаратуры. В этом примере фон 2000 срм, и, следовательно, достоверная величина измеряемого эффекта должна быть не ниже 6000 срм, что в 30 раз снижает чувствительность по сравнению с "идеальной" расчетной.

Использование фофора-32, а позднее и фосфора-33, начиналось еще в 50-х годах ХХ века, однако после разработки методов секвенирования ДНК с помощью фосфора-32 спрос на соединения, меченные фосфором-32, достиг просто огромных величин. В "пике" потребления нуклеотиды, меченные фосфором-32, производились в мире в объеме несколько десятков кюри ежемесячно (это десятки тысяч фасовок каждый месяц), и только флюоресцентные методы секвенирования спустили потребление радиоактивного фосфора с заоблачных высот к нынешнему состоянию.

Традиционно меченые фосфором нуклеотиды используются по нескольким направлениям:

1. Введение в ДНК (РНК) за счет нуклеозид-5' — [α-³²Р]-трифосфатов и изучение соответствующих ферментов.

2. Введение в олигонуклеотиды ³²Р фосфорилированием 5'-конца с помощью [γ-³²P] ATP и полинуклеотидкиназы.

3. Фосфорилирование белков протеинкиназами с помощью [γ-³²P] ATP.

Наиболее востребованным меченым соединением фосфора-32 является аденозин-5'-[γ-³²P] трифосфат, который обычно сокращенно обозначают [γ-³²P] АТР. Это вполне объяснимо, т.к. кроме широко известной методики введения ³²Р-метки на 5'-конец олигонуклеотида с помощью Т4 полинуклеотидкиназы, [γ-³²P] АТР используют для изучения различных фосфотрансфераз (киназ), в том числе и для биоскрининга химических библиотек протеин-киназными тестами. Нуклеозид-5'трифосфаты, меченные фосфором-32 в α-положении, сокращенно обозначают [α-³²Р] NТР или [α-³²Р] dNТР (рибо- или 2'-дезоксирибонуклеотиды соответственно) и используют, в основном, для введения "метки" в нуклеиновые кислоты с помощью РНК- или ДНК-полимераз. Естественно, сюда же примыкают исследования биосинтеза нуклеиновых кислот и их ферментативного аппарата. Технология введения ³²Р-метки в нуклеиновые кислоты подробно изложена в "классике методов" ( Маниатис Т. Фрич Э. Самбрук Дж. "Молекулярное клонирование" М. "Мир" 1984 г.). Поэтому я отмечу только некоторые характерные для начинающих ошибки.

Характеристики

Список файлов реферата