150712 (732809), страница 2

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 2)

При измерении активности (радиоактивности) любых образцов и для любых средств измерения необходимо помнить несколько простых, но важных правил:

1. Радиоактивный распад является классическим примером случайного, вероятностного природного процесса и, рассматривая измерение активности как регистрацию случайных событий, мы получаем математическую ошибку измерения активности:

n^1/2/n x 100%

где n — число "событий" (в нашем случае распадов)

Например, для 400 зарегистрированных импульсов на любом приборе независимо от времени измерения (наблюдения) 400^1/2 / 400 х 100% = 5%, т.е. ошибка 5%. Это означает, что чем больше число измерений (собственно счет), тем меньше математическая ошибка измерения. Более того, вопреки устоявшейся традиции, для снижения математической ошибки измерения надо считать не число зарегистрированных прибором распадов (импульсов) за единицу времени, а время, необходимое для "накопления нужного" числа импульсов — например, 10000 имп. Тем не менее, во всем мире активность с помощью счетчиков измеряют как количество импульсов за единицу времени (обычно по 1 минуте).

1. Все счетчики имеют верхний предел измерения, после которого их точность падает, так как счетчик не успевает регистрировать — "захлебывается". Для сцинтилляционных счетчиков — это активность на уровне 10⁶÷10⁷ расп./мин. Некоторые типы счетчиков имеют встроенную блокировку и отказываются считать образцы, активность которых превышает установленную для данной модели. Оптимальная активность образца для точного измерения 10⁴÷10⁶ расп./мин.

2. Проводя количественные измерения, например, определяя концентрацию радионуклида в растворе, всегда делайте хотя бы 2, а лучше 3 измерения независимых аликвот и активность определяйте как среднюю из 2 — 3 измерений. Затраты времени на "лишние" процедуры будут с лихвой компенсированы отсечением случайных "выбросов". Разброс в измерениях, особенно у начинающих исследователей, может достигать 200% и более, хотя в норме не должен превышать обычную ошибку рутинного отбора аликвот.

3. Ни один измерительный прибор не регистрирует 100% всех "распадов" (decompositions) в измеряемом образце. Эффективность счета — это коэффициент, который связывает зарегистрированные прибором импульсы (counts) и реальные распады (decompositions). Поэтому для любого измерения распады/мин. (dpm — decompositions per min.) больше импульсов/мин. (cpm — counts per min.). Правда, для большинства радионуклидов, применяемых в life science, эффективность жидкостного сцинтилляционного счета составляет более 90%. Однако, тритий удается измерять с эффективность не более 50÷60%. Обычно эффективность счета для каждого радионуклида указывается в технической документации к прибору, и долгое время негласное соревнование между фирмами за более высокую эффективность счета трития было чуть ли не главным двигателем технического прогресса в этой области.

4. Все измерительные приборы имеют собственный "фон" — регистрируют какое-то количество импульсов без источника ионизирующего излучения (радиоактивного препарата). Природа фона различна: космическое излучение, электронный шум, содержание природных радионуклидов в помещении, где установлена измерительная аппаратура и т.д. Поэтому минимально достоверная величина активности, измеряемая прибором, увязывается с фоном и обычно принимается равной трехкратному превышению фона данного прибора. Если в вашем "эпохальном" эксперименте активность "главного" образца едва-едва превышает фон, попытайтесь увеличить время измерения (можно до 20 мин.) — тогда достоверность измерения возрастёт.

5. В большинстве случаев в life science абсолютные измерения активности не нужны, и гораздо важнее получить информацию об относительной активности образцов: распределение активности по гелю, хроматографической пластинке или по элюированным с колонки продуктам; доля субстрата, превратившегося в продукт под действием фермента; доля лиганда, связанного с рецептором; детекция продуктов метаболизма соединения, меченного радионуклидом, и другие аналогичные задачи. Поэтому очень важно, чтобы условия приготовления и измерения образцов в конкретном эксперименте были одинаковыми, тогда абсолютные погрешности в измерениях не окажут существенного влияния на биологические результаты.
   Наиболее ярко эту относительность измерений иллюстрирует широкое использование минимониторов — приборов, предназначенных для определения загрязнения поверхностей рабочих столов, одежды и т.д. Небольшие карманные приборы, имеющие ионизационный счетчик (обычно это ионизационная камера или счетчик Гейгера), оказались очень удобными для детекции меченного фосфором-32 фрагмента ДНК в агарозном геле или меченного йодом-125 белка в ПААГ и т.п. Некоторые ухитряются по показаниям такого прибора оценивать включение меченых предшественников биосинтеза в биополимеры после разделения продуктов реакции, используют мониторы для измерения активности образцов на фильтрах, кусках фильтровальной или хроматографической бумаги и даже в пробирках. Это удобно и полезно для качественных и полуколичественных оценок, но следует помнить , что приборные ошибки в таких измерениях могут быть очень значительными и достигать 200—300%.

Жидкостные сцинтилляционные счетчики уже многие годы остаются главным инструментом для количественного измерения радионуклидов в life science. Несмотря на разнообразие конструкций, с точки зрения пользователя, все они измеряют активность образцов, помещенных в специальный стеклянный или пластиковый флакон и заполненный жидким сцинтиллятором. Поскольку измерение активности сводится к подсчету вспышек света, жидкость во флаконе должна быть прозрачная для счета и гомогенная по составу. Все отклонения от этого требования снижают эффективность счета, причем иногда существенно. Образование осадка или двухфазной несмешивающейся жидкой системы, наличие образцов биологических тканей или фильтровальных материалов — все эти факторы снижают эффективность счета. То же самое касается добавок многих химических веществ: кислот, щелочей, концентрированных растворов сахаров, солей, мочевины и многое другое. Особенно это касается измерений трития, где разница в эффективности счета для гомогенного, почти идеального, образца и образца, нанесенного на хроматографический сорбент, может быть в 10÷30 раз и даже больше. Это необходимо учитывать, если при составлении баланса по активности вдруг куда-то исчезнет часть радиоактивного материала или откуда-то внезапно появится "лишнее".

Составы сцинтилляторов весьма разнообразны и фирмы, производящие сцинтилляционные коктейли, часто не раскрывают их состав. Классический (едва ли не самым первый) жидкий сцинтиллятор — это толуольный раствор 2,5-дифенилоксазола (РРО) с добавкой 1,4-ди-[2-фенил-(5-окзазолил)]-бензола (РОРОР). Состав: 4 г РРО и 0,2 г РОРОР на 1 л толуола. Не вдаваясь в подробности, следует подчеркнуть, что это — неводная система, а водные растворы считать в таком сцинтилляторе не принято. Для измерения водных проб к такому сцинтиллятору добавляют тритон Х-100 до 30% по объему.

Другим вариантом "водолюбивого" сцинтиллятора является диоксановый: 60 г нафталина, 4 г РРО, 0,2 г РОРОР, 200 мл спирта и до 1 л диоксан марки "сцинтиляционный". Впрочем, большинство исследователей сегодня успешно пользуются готовыми фирменными коктейлями, справедливо не задумываясь над их составом.

Важными источниками ошибок для жидкостного сцинтилляционного счета являются "засветка" сцинтилляционной жидкости и электризация счетных флаконов. Оба эффекта легко нейтрализуются во времени (не спешите сразу считать, дайте пробам постоять в темном пространстве прибора несколько минут), кроме того, электризация почему-то чаще проявляется на стеклянных флаконах, и реже — на одноразовых пластиковых.

Внедрение в технологию биоскрининга радиометрических методов анализа подвигло разработчиков на создание высокопроизводительных сцинтилляционных счетчиков для измерения активности в планшетах. Для радиоактивных изотопов фосфора прибор используется в модификации с внешним твердым сцинтиллятором, который и является детектором. Для трития твердый сцинтиллятор добавляют прямо в лунку планшета в виде специальных бусинок и, так как эти бусинки являются одновременно компонентом биохимической реакции, то связанный с "бусами" меченый тритием лиганд считается сцинтиллятором, а не связанный, находящийся в растворе, — не считается. С радиохимической точки зрения эффективность счета в таких измерениях очень низкая, но для биоскрининга важно относительное распределение меченых соединений в системе "связанный-несвязанный", а высокая производительность и простота операций оправдывают колоссальные затраты на реализацию таких методов.

2.3. Иммиджеры

Очень полезной и эффективной оказалась "электронная авторадиография", возникшая сравнительно недавно, как результат развития микроэлектроники и компьютерной техники.

Фосфоимиджер — прибор для "электронной авторадиографии" фосфора-32. Кассета с многократно используемым экраном экспонируется с плоским образцом: гелем, хроматографической пластинкой и т.п. Затем экран помещается в прибор, в котором с помощью лазерного сканирования определяется местоположение и активность радиоактивного материала, экспонировавшегося с экраном.

Другая вариация на эту тему — это использование газопроточных счетчиков для "электронной авторадиографии". Представьте себе щетку для одежды, каждый волосок которой диаметром 0,2 мм является индивидуальным газопроточным счетчиком. Если вы совместите такую "щетку" общим размером 18 х 24 см с исследуемым плоским образцом, то на экране компьютера в реальном времени вы сможете наблюдать количественную картинку распределения "радиоактивных веществ" на плоскости вашего образца. Разные модификации такого прибора позволяют работать практически со всеми радионуклидами, которые применяются в life science.

Эффективность счета в этих приборах, конечно, не может быть высокой, однако для практической работы в life science этот недостаток с лихвой компенсируется быстротой и удобством "электронной авторадиографии", а также возможностью получения результата сразу в электронном виде.

3. Классификация и номенклатура

Все радиоактивные источники с технологической точки зрения делятся на закрытые и открытые. Закрытые источники — это радиоактивные препараты, помещенные в специальную защитную герметичную упаковку (как правило стальную), — предназначены для работ без вскрытия защитной оболочки.

В молекулярно-биологических и биохимических исследованиях используют открытые источники — твердые, жидкие или газообразные радиоактивные вещества или их растворы. Практически все радиоактивные препараты, применяемые в life science — это растворы соединений, меченных радиоактивными изотопами.

Для обозначения конкретного изотопа (в том числе и радиоактивного), согласно правилам номенклатуры, перед химическим символом элемента ставится надстрочечное число, обозначающее массу изотопа. Например, ¹⁴С — изотоп углерода с массой 14. В литературе допускается полное написание химического элемента и его массы через дефис, например, углерод-14. Обратите внимание, что пишется ¹⁴С, а произносится обычно С-14, т.е. для любого изотопа при написании первым всегда указывается массовое число изотопа над строкой, а затем символ химического элемента, а произносят наоборот: сначала элемент, затем масса изотопа.

Соединения, меченные радиоактивными изотопами, делят на две группы веществ. Во-первых, это конкретные химические соединения, у которых один атом (или несколько) заменён на атом радиоактивного изотопа того же элемента, т.е. химически такое соединение идентично "немеченому". Во-вторых, это молекулы соединений, модифицированные с помощью радиоактивного фрагмента (или дополнительного радиоактивного атома), которые отличаются от исходного немеченого соединения. К последнему случаю относятся всевозможные конъюгаты и модификации биологических макромолекул с неопределенным местоположением радиоактивного атома, например, молекула иммуноглобулина с введенным изотопом радиоактивного йода-125. Более подробно об этом ниже.

Для обозначения меченых соединений первой группы принято в обычное химическое наименование молекулы вставлять в квадратных скобках наименование изотопа, которым мечено соединение, и его место в молекуле перед названием части молекулы, содержащей меченый атом. В качестве примера ниже приведены наименования тимидин-5'-трифосфата, меченного различными радионуклидами и в разных положениях:

1. [6-³H] тимидин-5' трифосфат

2. [метил-³H] тимидин-5' трифосфат

3. [U-³H] тимидин-5' трифосфат

4. [5'-³H] тимидин-5' трифосфат

5. [6,2',3'-³H] тимидин-5' трифосфат

6. [2-¹⁴С] тимидин-5' трифосфат

7. [U-¹⁴С] тимидин-5' трифосфат

8. тимидин -5' [α-³²P] трифосфат

9. тимидин -5' [γ-³²P] трифосфат

В примерах 3 и 7 место радиоактивного атома в молекуле обозначено U — это означает, что точное место радиоактивного атома неизвестно и, возможно, речь идет о равномерно меченой молекуле. Обычно такое бывает, если способ получения соединения заключался в выращивании микроорганизма на среде, обогащённой целевым изотопом, с последующим выделением нужного соединения из клеточного лизата. Подробнее методы получения меченых соединений обсуждаются в других разделах. В примерах 8 и 9 α и γ — это не тип радиоактивного распада, а местоположение радиоактивных атомов фосфора-32 в трифосфатной группе.

Для наименования второй группы соединений обозначение радионуклида в квадратных скобках выносят перед наименованием молекулы: [¹²⁵I]-альбумин — альбумин, меченный йодом-125 или [метил -³H]-альбумин — альбумин, меченный тритием за счет метилирования молекулы [³H]-метильной группой йодистого метила.

Характеристики

Список файлов реферата