10991 (684972), страница 4

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 4)

При хронических гепатитах и циррозах печени соотношение трансаминаз меняется, и коэффициент повышается выше нормы. Важно иметь в виду, что механические желтухи (непроходимость желчных протоков в связи с желчекаменой болезнью или опухолью) не сопровождаются выраженным повышением трансаминазной активности. Возможно повышение активности трансаминаз при воспалительных заболеваниях различных органов и тканей, при мышечных дистрофиях и т. д. /37,38/.

Таким образом, в настоящее время установлено, что переаминирование является весьма важным и распространенным процессом биологического распада и синтеза аминокислот; он протекает в различных тканях животных, растений и в микроорганизмах. Поэтому исследование этого процесса имеет большое фундаментальное и прикладное значение.

2. Материалы и методы

2.1 Экспериментальная часть

2.1.1 Экспериментальные животные

Эксперимент проводился на самках белых беспородных крыс средней массы 250-300 г. Животные подвергались токсическому действию азотнокислого кадмия (Cd(NO3)2) во время лактации. Введение нитрата кадмия производилось самкам per os в течение 10 дней (с 1 по 10 день после рождения потомства) в дозах 0,5 мг/кг и 2 мг/кг /39/. По достижении потомством экспериментальных животных четырехмесячного возраста их декапитировали и производили отбор органов и тканей для определения активности АСТ и АЛТ.

В качестве контроля использовали животных, которым в период лактации вводили в соответствующем объеме физиологический раствор.

2.1.2 Подготовка биологического материала

2.1.2.1 Подготовка сыворотки крови

После декапитации животных кровь собирали в гепаринизированные пробирки и для получения сыворотки подвергают центрифугированию, при 3000 об/мин, в течение 15 минут. После центрифугирования получали сыворотку, не содержащую форменных элементов крови. Затем отбирали сыворотку в пробирки, и производили определение активности АСТ и АЛТ методом Райтмана – Френкеля/40/ с помощью стандартных наборов реактивов.

2.1.2.2 Подготовка гомогенатов тканей и органов

Извлеченные органы (печень, головной мозг, сердце, почки) отмывали от крови физиологическим раствором, взвешивали 1-2 грамма ткани, измельчали ножницами и растирали в ступке. Все операции производили на холоду. Затем добавляли среду выделения (0,005 N Tris, 0,1 N KСl, pH7,4) в отношении 1: 50 для головного мозга, сердца и почек, и 1:100 – для печени. Полученные гомогенаты переносили в центрифужные пробирки и центрифугировали при 4500 об/мин 10 минут. После центрифугирования супернатант переносили в другие пробирки, а осадок выбрасывали. Далее в супернатанте производили определение активности АСТ и АЛТ методом Райтмана – Френкеля /40/ при помощи стандартных наборов реактивов.

2.2. Определение активности аминотрансфераз методом Райтмана – Френкеля

АСТ в присутствии L - кетоглутарата катализирует реакцию переаминирования L - -аспартата с образованием оксалоацетата, который декарбоксилируется до пирувата /41/:

L – кетоглутарат + L - аспартат → L – глутамат + оксалоацетат → ПВК

АЛТ в присутствии L – кетоглутарата катализирует реакцию переаминирования L – аланина с образованием пирувата /41/:

L – кетоглутарат + L - аланин → L – глутамат + ПВК

Пируват с 2,4 – динитрофенилгидразином (2,4 - ДНФГ) в щелочной среде образует окрашенный гидразон, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна активности АСТ и АЛТ.

2.2.1 Определение активности аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы в сыворотке крови

В обычные пробирки наливали 0,5 мл субстрата (L – аспартат (L - аланин) 0,1 моль/л, L – кетоглутарат 2 ммоль/л, фосфатный буфер 0,1 моль/л) и 0,1 мл сыворотки крови. Параллельно ставили контрольные пробы, в которые не добавляли сыворотку. Пробы тщательно перемешивали и инкубировали в течение 1 часа – АСТ и 30 минут – АЛТ при 37С на водяной бане. После этого к опытным и контрольным пробам приливали по 0,5 мл раствора 2,4 – ДНФГ. В пробирки с контролем только после добавления 2,4 – ДНФГ приливали 0,1 мл сыворотки крови. Через 20 минут (20-25 ^оС) в пробирки приливали по 5 мл 0,4 моль/л раствора NaOH, хорошо перемешивали и через 5-10 минут фотометрировали против холостой пробы в интервале длин волн 500-560 нм (opt 537нм) в кюветах толщиной 1см.

Расчет активности ферментов в сыворотке крови производили по калибровочному графику. Каталитическую активность АСТ(АЛТ) рассчитывали в мкмоль/(с·л) по формуле: каталитическая концентрация АСТ(АЛТ)= (Епр – Ек)К, где К – коэффициент рассчитанный по калибровочному графику: К=С/Е, Епр – экстинция пробы, Ек – экстинция контроля.

Калибровочный график для определения активности аминотрансфераз строили таким образом, чтобы в пробах находилось от 0,05 до 0,30 мл стандартного раствора пирувата. К пробам, содержащим от 0,5 до 0,25 мл субстрата (0,05; 0,10; 0,15; 0,20; 025; 0,30 мл пирувата), добавляли 0,5мл раствора 2,4 – ДНФГ, инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем во все пробирки приливали по 5 мл 0,4 Н NaOH, хорошо перемешивали и через 30 минут в пробирках № 2-6 измеряли оптическую плотность при 537 нм против раствора в пробирке № 1. Калибровочный график строили, откладывая на оси ординат значения оптической плотности для каждой пробы, а на оси абсцисс – соответствующие им значения активности АСТ и АЛТ.

2.2.2 Определение активности аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы в гомогенатах органов

В пробирки наливали 0,1 мл разбавленного гомогената тканей печени, головного мозга, сердца, почек и 0,5 мл субстрата (субстрат предварительно нагревали на водяной бане до 37 ^оС). Параллельно ставили контрольные пробы, в которые не добавляли субстрата. Пробы хорошо перемешивали и инкубировали в течение 1 часа при 37 ^о С на водяной бане. После этого к опытным и контрольным пробам прибавляли по 0,5 мл раствора 2,4 – ДНФГ. В пробирки с контролем только после добавления 2,4 – ДНФГ приливали 0,5 субстрата. Пробы оставляли на 20 минут при комнатной температуре, затем во все пробирки приливали по 5 мл 0,4 Н NaOH, тщательно перемешивали и через 30 минут измеряли оптическую плотность при 505 нм, в кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см.

Расчет активности ферментов в гомогенатах органов производили по калибровочному графику. Каталитическую активность АСТ(АЛТ) рассчитывали в мкмоль/(с·л) по формуле: АСТ(АЛТ) = (Епр- Ек)К, где К – коэффициент рассчитанный по калибровочному графику: К=С/Е, Епр - экстинция пробы, Ек – экстинция контроля.

Калибровочный график для определения аминотрансфераз в гомогенатах тканей строили так же, как для сыворотки крови. Для расчета активности ферментов учитывали все разведения гомогената и выражали в пересчете на 1 грамм ткани (мг белка).

Все экспериментальные группы содержали от 7 до 9 животных, полученные данные были подвергнуты статистической обработке. Достоверность различий между группами оценивали с учетом критерия Стюдента, в соответствии с общепринятой методикой /42/.

Результаты и обсуждение

Трансаминазы являются важнейшими ферментами обмена веществ. Аспартатаминотрансфераза (АСТ) и аланинаминотрансфераза (АЛТ) - близкие по действию ферменты, при участии которых в организме человека осуществляется межмолекулярный перенос аминогрупп с аминокислот на кетокислоты. Этот процесс - трансаминирование - ответственен за синтез и разрушение отдельных аминокислот в организме. В процессе переаминирования, осуществляют связь углеродного и белкового обмена /36/. В связи с этим, изучение влияния ионов кадмия как распространенного экотоксиканта, принадлежащего к группе тяжелых металлов, представляет несомненный интерес.

В ходе исследования активности аланинаминотрансферазы (КФ.2.6.1.2.) и аспартатаминотрансферазы (КФ.2.6.1.1.) были получены следующие результаты.

Таблица 1- Активность аланинтрансаминазы в сыворотке крови и гомогенатах органов 4-х месячных самок крыс подвергшихся хроническому действию кадмия в неонатальный период

В результате эксперимента было установлено снижение активности АЛТ в гомогенате печени в выбранных дозах в 2 раза (р<0,003) по отношению к контролю, как показано в таблице1 и на рисунке Б.1.

У самок опытной группы в сыворотке крови происходило увеличение достоверное увеличение активности АЛТ в группе 0,5 мг/кг в 2,7р (р<0.02) и в группе 2 мг/кг в 3 раза (р<0,001) таблица 1, рисунок А.1.

В гомогенате мозга нами не было выявлено достоверных различий в изменении активности АЛТ, хотя наблюдалась тенденция к её снижению, что отражено в таблице 1 и на рисунке В.1.

В гомогенате почек при дозе 0,5 мг/кг активность АЛТ уменьшилась в 2,5 раза (р<0,004) по отношению к контролю, а при дозе 2 мг/кг по отношению контролю уменьшилась более, чем в 3 раза (р<0,005) (таблица1,рисунок Д.1). Статистически достоверных различий в активности фермента между дозой 0,5 мг/кг и 2 мг/кг выявлено не было.

В гомогенате сердца достоверных изменений активности АЛТ в дозах как 0,5 мг/кг, так и 2 мг/кг не наблюдалось (таблица 1 Приложение Г.1).

В работе также было изучено изменение активности аспартатаминотрансферазы у потомства белых крыс, подвергшихся токсическому действию солей кадмия в период лактации.

Активность АСТ в гомогенате печени при дозе 0,5 мг/кг по сравнению с контролем достоверно не изменилась, тогда как при дозе 2 мг/кг - повысилась более чем в 2,5 раза (р<0,03) таблица 2, приложение Б.2.

При введении экспериментальным животным нитрата кадмия в дозе 0,5 мг/кг, у их потомства не наблюдалось статистически достоверного изменения активности АСТ в сыворотке крови по сравнению с контролем. При дозе 2 мг/кг отмечено уменьшение активности АСТ сыворотке примерно 6 раз (р<0,05) по сравнению с контролем. Полученные данные представлены в таблице 2, рисунке А.2.

Таблица 2-Активность аспартаттрансаминазы в сыворотке крови и гомогенатах органов 4-х месячных самок крыс подвергшихся хроническому действию кадмия в неонатальный период

В таблице 2, рисунке В.2 показано, что гомогенате мозга при дозе 0,5 мг/кг активность АСТ достоверно не изменилась (р<0,84) по сравнению с контролем. Введение лактирующим крысам нитрата кадмия в дозе 2 мг/кг привело к увеличению активности АСТ в гомогенате мозга потомства почти в 2 раза (р <0,05) по отношению к контролю.

При изучении токсического действия ионов кадмия на потомство белых крыс было обнаружено, что в гомогенате почек при дозе 0,5 мг/кг активность АСТ по сравнению с контролем достоверно не изменялась (р<0,68) (таблица 2, рисунок Д.2). При дозе 2 мг/кг активность АСТ увеличилась 2,3 раз (р<0,02 по сравнению с контролем) (таблица2, рисунок Д.2).

Определение активности аспартатаминотрансферазы в гомогенате сердца показало увеличение активности 1,4 раза (р<0,02) по сравнению с контрольными значениями при дозе 0,5 мг/кг. Увеличение дозы токсиканта до 2 мг/кг не приводило к статистически достоверным изменениям активности фермента по отношению к контролю таблица 2, рисунок Г.2.

Полученные в результате эксперимента данные можно объяснить следующим образом: Печень и почки являются органами мишенями при кадмиевой интоксикации выявленное уменьшение активности АЛТ в гомогенате печени можно объяснить тем что, кадмий повреждает клетки печени (гепатоциты), что сопровождается выходом фермента в кровоток /44/. Поскольку максимальное количество АЛТ содержится в печени /54/, то при поражении клеток печени активность АЛТ в крови возрастает, хотя АЛТ является внутриклеточным ферментом, и его содержание в сыворотке крови здоровых людей невелико /41,44/. Поэтому определение активности фермента в сыворотке крови широко используется для диагностики болезней печени.

В мозге и сердце нами не было выявлено достоверных изменений в активности АЛТ, поскольку АЛТ является маркером периферической зоны катаболизма /55/, и его содержание в этих тканях мало, по сравнению например с печенью, изменение активности данного фермента не может быть индикатором тяжёлых нарушений происходящих в них, что мы не можем сказать об активности АСТ, которая повышалась в этих органах.

Наблюдаемое нами уменьшение активности АЛТ в почках может быть следствием того, что происходит ингибирование данного фермента ионами кадмия, можно предположить, что реакция переаминирования аланина при этом протекает медленнее, что приводит к снижению образования глутамата, который является одним из основных участников системы обезвреживания аммиака в организме. В результате в организме может происходить увеличение содержания аммиака в клетках, который является токсичным для организма и должен обезвреживаться, в этом принимает участие фермент АСТ (см. ниже).

Второй фермент, активность которого мы исследовали –АСТ - ключевой фермент обмена веществ, именно он обеспечивает поступление субстратов в цикл трикарбоновых кислот (ЦТК) /55/, занимая «центральную» роль в метаболизме. Субстраты этого фермента: аспартат, глутамат, пируват и α -кетоглутарат являются самыми древними и присутствуют у всех биологических объектов, занимая ключевую роль в обмене веществ. Значительная активность АСТ обеспечивает интенсификацию как поступления метаболитов в ЦТК, так и ускоряет работу последнего, что и ведёт к усилению окислительного фосфорилирования /47/.

В ходе нашего исследования было обнаружено увеличение активности АСТ в печени. Это увеличение можно объяснить тем, что в печени происходит усиленный синтез этого фермента, это может быть связано с тем, что происходит распад белков под действием ионов кадмия, что увеличивает содержание свободных аминокислот в организме, это «субстрат» для трансаминирования /46/. Снижение этого фермента в сыворотке крови говорит о связывании фермента по двум его активным центрам с его SH - группами, что наблюдается в значительном снижении активности /49/.

Увеличение активности АСТ в мозге, возможно, является компенсаторным на уменьшение синтеза глутамата в результате снижения скорости реакции катализируемой АЛТ /43/. Уменьшение синтеза глутамата приводит к повышению уровня аммиака в крови, который способен проникать через гематоэнцефалический барьер в головной мозг, где оказывает нейротоксический эффект /43/. Аммиак может усиливать нейротоксический эффект меркаптанов и короткоцепочечных жирных кислот концентрация которых может быть повышена в клетках печени при их поражении /49/. В астроцитах мозга аммиак обезвреживается в результате глутаматсинтазной реакции с образованием глутамина. Образование глутамина в астроцитах приводит к оттоку глутамата, который в результате усиления активности АСТ частично восстанавливает расход глутамата /55/. Когда происходит отток глутамата из малат-аспартатного челнока митохондрий происходит снижение синтеза АТФ, которую астроцит использует не только для внутренних потребностей, но и для снабжения ею нейронов, что приводит к гипоэнергетическому состоянию ЦНС. Увеличение активности АСТ приводит к увеличению образования глутамата, ответственного за связывания аммиака. Частичное обезвреживание аммиака происходит за счёт синтеза аспарагина из аспартата, являющимся одним из субстратов реакции трансаминирования /48/. Как было отмечено, отток глутамата сопровождается снижением синтеза АТФ что приводит к гипоэнергетическому состоянию, и это не может не изменить активности другого фермента ответственного за связывание аммиака в организме – глутаматдегидрогеназы, являющимся регуляторным механизмом обмена аминокислот. Понижение концентрации аденозиндифосфата (АДФ) активирует этот фермент, т. е. низкий энергетический уровень в клетках стимулирует разрушение аминокислот с образованием - кетоглутарата, часть которого связывается с аммиаком, а часть поступает в ЦТК как энергетический субстрат. Клетки мозга нуждаются в притоке энергии, они чувствительны к токсическому воздействию аммиака, в мозге помимо повышения активности АСТ существует множество механизмов обеспечивающих нормальное функционирование этой ткани.

Повышение активности АСТ в почках, возможно, связано с удалением ионов аммония образовавшегося при распаде белков, дезаминировании аминокислот /47,55/

Характеристики

Список файлов ВКР