91895 (680294), страница 4

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 4)

Из большого количества проанализированных клеточных культур для литической инфекции и роста различных штаммов HVS наиболее пригодной оказалась линия клеток почки обезьян дурукули. Кроме того, за небольшим исключением, для получения заготовок HVS можно использовать и клетки линии Vero. Клетки ОМК можно выращивать на большинстве культуральных сред с добавлением ТС.

Для получения заготовок вируса клетки ОМК, растущие в роллерных флаконах, заражают вирусом и культивируют 4–5 дней при 37°С. Оптимальная температура культивирования – 34°С. Однако культивирование при этой температуре может привести к возникновению температурно-чувствительных мутантов. ЦПД проявляется в образовании шарообразных агрегатов клеток, не являющихся истинными синцитиями.

Как правило, ЦПД удается обнаружить на 4–5 день после заражения, хотя эти сроки могут варьировать для различных штаммов. Дочерние вирусы высвобождаются в культуральную среду, при этом в 50 мл среды одного роллерного флакона содержится примерно 2–10⁶–2-10⁷ БОЕ/мл. Вирусную суспензию с таким титром следует хранить при –70°С, кроме того, вирус можно предварительно сконцентрировать осаждением. Осажденный вирус обычно характеризуют отношением числа физических частиц к инфекционным. Для штамма HVS 11 данное отношение составляет 200–500, этот штамм на редкость стабилен при 4°С. Он теряет за месяц при хранении в культуральной среде всего лишь 0,51g инфекционности.

Таблица 3. Характерные особенности белков CMV

3.2 Титрование вируса

HVS в соответствующих разведениях обычно титруют на монослое клеток Vero или ОМК, растущих в 25 см² пластиковых флаконах с плоским дном. Вирус титруют методом бляшек. Необходимо отметить, что некоторые партии телячьей сыворотки ингибируют формирование бляшек в культурах ОМК. Во избежание этого сыворотку выдерживают 30 мин при 56°С.

1. Адсорбируют аликвоты соответствующих разведений вируса объемом 1 мл 1–2 ч при 37°С.

2. Аликвоты заменяют на культуральную среду, содержащую 2% ТС и 0,5% КМЦ.

3. Через 7–10 дней инкубации при 37°С начинают формироваться мелкие бляшки. Через 14 дней диаметр бляшек достигает 2–3 мм, хотя, конечно же, данный признак специфичен для каждого штамма.

Немного раньше бляшки формируются в монослойных первичных культурах мармозеток. На рис. 13 показана морфология бляшек HVS через 6 и 9 дней после начала инфекции.

3.3 Цикл размножения

Обычно для получения кривых роста в культуры вносят вирус с высокой множественностью инфекции, а затем через короткие промежутки времени собирают вирус. Таким образом, получают кривую роста HVS. Однако интерпретировать полученные результаты следует с осторожностью. Рэн-делл и Хонес показали, что в этих условиях во многих клетках задерживается инициация вирусной репликации. Если это действительно так, то цикл размножения HVS в одной инфицированной клетке может завершиться за 18 ч.

Возможно, что репликация вируса зависит и от клеточного цикла. Эти сложные исследования велись с помощью иммунофлуоресценции на основе моноклинальных антител к антигенам зараженных клеток.

3.4 Получение очищенного вируса

1. Монослойные культуры, выращиваемые в роллерных флаконах, инфицируют с низкой множественностью инфекции, как описано выше. Через 4–5 дней вирус осаждают из культуральной среды центрифугированием при 25000 об/мин 30 мин в роторе SW27. При необходимости через 2 дня после заражения вносят радиоактивную метку.

2. Осадок ресуспендируют в соответствующем буфере. Полученную суспензию по возможности следует оставить на ночь при 4°С.

3. Суспендированный осадок наслаивают на градиент глицерина или сахарозы и центрифугируют при 19000 об/мин 20–30 мин в роторе SW27. После центрифугирования при просмотре пробирок в рассеянном свете обнаруживается одна полоса в центре градиента.

4. Фракцию, состоящую более чем на 90% из вирусных частиц, имеющих оболочку, отбирают, центрифугируют 1 ч при 25000 об/мин и ресуспендируют в соответствующем буфере.

В результате первого градиентного центрифугирования получают осадок, содержащий большое количество вируса. Осадок можно ресуспендировать и дополнительно очистить вторым градиентным центрифугированием. Фракции очищенного вируса могут быть использованы для определения концентрации белка, количества физических частиц и инфекционного титра. Для исследования вирусных частиц электрофорезом в полиакриламидном геле вирус разрушают, как описано выше для ВПГ. Спектр структурных полипептидов HVS штамма 11 показан на рис. 16.

Характеристики

Список файлов реферата