91280 (679838), страница 3

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 3)

1. “+” - позитивний результат;

2. “-“ - негативний результат.

У 12 хворих співпадав позитивний результат при діагностиці ШКМ та ПЛР, що складало 70% (рис. 3). Трьома методами однакові результати було отримано тільки у 5-ти випадках, що складало 30%. Швидкий культуральний метод та метод прямої детекції АГ у 5-ти випадках виявляв кількість антиген-позитивних клітин, що супроводжувалось наявністю клінічних симптомів у хворих і може характеризувати інфекцію як гостру, в наслідок реактивації персистентної інфекції (усі пацієнти приймали раніше анти-ЦМВ терапію). У 5-ти інших хворих ШКМ та методом детекції антигенемії ЦМВ виділено не було, а ДНК методом ПЛР виявлялось. Це також пояснюється тим, що метод ПЛР є дуже чутливим, і виявляє ДНК вірусу навіть коли інфекція перебуває у персистентній формі.

Аналіз результатів дозволяє зробити висновок, що отримані нами дані вказують на високу ступінь співпадання результатів тесту на виявлення антигенемії та швидкого культурального методу, а також клінічними проявами ЦМВІ. Висока чутливість тесту на виявлення антигенемії дає можливість швидко діагностувати гостру форму ЦМВІ у пацієнтів після трансплантації нирки, до того ж антигенемія може бути виявлена протягом 3-4 год.

Таким чином, отримані дані по виявленню ранніх білків ЦМВ за допомогою нових швидких діагностичних методів показали їх діагностичну цінність і дозволяють застосовувати їх у медичних закладах. Ефективність швидкого культурального методу становила 70% у хворих після трансплантації нирки.

Дослідження антивірусної активності 6-аzaC. Вивчали цитотоксичність 6-azaC у культурі ФЛЕЛ за дією на життєздатність клітин використовуючи барвник трипановий синій. Було встановлено, що на 3-ю добу культивування клітин з 6-azaC у концентраціях від 50000 мкг/мл до 30000 мкг/мл життєздатних клітин у дослідах не спостерігалось. У присутності 6-azaC у концентрації 26000 мкг/мл кількість життєздатних клітин складала - 20% від контролю клітин, а при концентрації 20000 мкг/мл - 80%. 6-azaC у концентрації 10000 мкг/мл виявляв незначну цитотоксичну дію, кількість життєздатних клітин складала - 95%. Нижчі концентрації 6-azaC на життєздатність клітин протягом 3-х діб культивування не впливали. Отримані результати представлені на рис. 4. Життєздатність клітин у 100% зберігалася протягом 7-и діб у присутності у концентрації 2000 мкг/мл, і протягом 10-и діб при концентраціях речовини 500 мкг/мл – 100 мкг/мл. Розрахунки зроблені за графіком показали, що цитотоксична доза (СD50) 6-azaC, тобто така, що не спричиняла незворотніх змін у морфології та життєздатності клітин на 3-ю добу складала – 24000 мкг/мл.

Дослідження цитотоксичної дії 6-azaC на синтез ДНК клітин ФЛЕЛ показало, що у контрольній культурі через 1 добу 30% клітин перебували у стадії синтезу ДНК. У процесі культивування кількість мічених клітин у контрольній культурі поступово знижувалася. Через 3-и доби кількість мічених клітин складала 12%.

Рис. 4. Цитотоксичний вплив 6-azaC на кількість життєздатних клітин ФЛЕЛ

по осі ординат- % життєздатних клітин від контролю клітин,

по осі абсцис – концентрація 6-azaC, мкг/мл

У культурі, обробленій 6-azaC концентраціями від 12000 мкг/мл до 240 мкг/мл, число клітин, із пригніченим синтезом ДНК через 1 добу незначно відрізнялось від контролю (рис. 5). Однак, через 3 доби число клітин, що синтезували ДНК, знизилось щодо контрольної популяції на 50% у присутності 2400 мкг/мл 6-azaC, а при концентрації 24000 мкг/мл практично на 100%. Отримані дані показують, що на 3-ю добу 50% зниження числа клітин, що синтезують ДНК, відбувалося при концентрації 6-azaC - 2400 мкг/мл.

Таким чином, було встановлено, що концентрація препарату що на 50% пригнічувала синтез ДНК і на 50% інгібувала приріст клітин (CD50) для 6-azaC становила - 2400 мкг/мл, і виявилася значно нижче концентрації, що впливала на життєздатність клітин – 24000 мкг/мл.

Дослідження антивірусної активності 6-azaC показало, що у терапевтичній схемі використання 6-azaC у концентраціях від 500 мкг/мл до 300 мкг/мл призводили до 100% пригнічення розвитку ЦПД вірусу при інфекційній множинності (ІМ) 0,001 БУО/кл і 0,0001БУО/кл. Аналіз дозозалежності дії 6-azaC показав, що 50% ефективна доза (ЕD₅₀) при ІМ 0,001 БУО/кл складає 100 мкг/мл, при ІМ 0,0001 БУО/кл - 50 мкг/мл (рис. 6). При концентрації 6-azaC 10 мкг/мл і нижче інгібуючого ефекту не спостерігалось. ІS для 6-azaC у терапевтичній схемі при ІМ 0,001 БУО/кл складав 24, а при ІМ 0,0001БУО/кл – 48.

Рис. 5. Цитотоксична дія 6-azaC на пригнічення синтезу ДНК клітин ФЛЕЛ

по осі ординат- % від контролю клітин, що синтезують ДНК,

по осі абсцис – концентрація 6-azaC, мкг/мл.

При дослідженні впливу 6-azaC на розвиток вірусної ЦПД у профілактичній схемі було встановлено, що при ІМ 0,0001 БУО/кл концентрації 10мкг/мл і 100 мкг/мл призводили до пригнічення вірусоспецифічної ЦПД на 70%, при 1000 мкг/мл - на 90%, при ІМ 0,001 БУО/кл концентрація 10 мкг/мл пригнічувала ЦПД вірусу на 13%, 100 мкг/мл і 1000 мкг/мл - на 30% і 33% відповідно (рис. 7).

Вивчення антивірусної дії 6-azaC показало, що препарат ефективно пригнічує репродукцію ЦМВ у культурі клітин при профілактичній схемі застосування. Було встановлено, що інгібуюча доза ED₇₀, що відповідає концентрації 6-azaC, при якій спостерігалося 70% пригнічення утворення включень ЦМВ, становила 10 мкг/мл. ІS даного засобу при ІМ 0,0001 БУО/кл складав 240.

Дослідження впливу 6-azaC на синтез вірусних білків показав, що у концентраціях 100 мкг/мл і 1000 мкг/мл число клітин інфікованих ЦМВ, що містили білки р72 і рр65 у присутності сполуки 6-azaC практично не відрізнялось як від контрольної популяції клітин, так і від культури, обробленої ганцикловіром.

Структурний білок gВ був зареєстрований у 2,5% клітин контрольної культури через три доби після зараження, у той час як у клітинах оброблених 6-azaC у концентраціях 1000 мкг/мл і 3000 мкг/мл кількість клітин, що ситезували gВ складало 1% і 0,5% відповідно. Максимальне розходження результатів у числі клітин, що синтезували gВ, було відзначено на п’яту добу після зараження, коли число клітин, що містили вірусний білок у необробленій популяції було у 10 разів більше, ніж у досліді. Під дією 6-azaC і ганцикловіру нагромадження пізнього структурного білку gВ було знижено приблизно однаковою мірою.

Таким чином було встановлено, що (СD50) 6-azaC, що не спричиняла незворотніх змін у морфології та життєздатності клітин на 3-ю добу складала – 24000 мкг/мл, а концентрація препарату що на 50% пригнічувала синтез ДНК (CD50) становила - 2400 мкг/мл. 50% ефективна доза (ЕD₅₀) у терапевтичній схемі застосування при ІМ 0,001 БУО/кл відповідала 100 мкг/мл, при ІМ 0,0001 БУО/кл – ED₅₀ - 50 мкг/мл. Індекс селективності (ІS) для 6-azaC в залежності від множинності інфікування складав 48-240.

Оцінка анти-ЦМВ активності амізону. Цитотоксичність амізону за дією на життєздатність клітин вивчали використовуючи сполуку у концентраціях 0,1 мкг/мл - 1000 мкг/мл. Протягом першої доби культивування амізон виявляв незначну цитотоксичну дію (рис. 8). На 3-ю добу культивування при концентрації амізону 1000 мкг/мл спостерігалася загибель 80% клітин. У присутності препарату амізон у концентрації 800 мкг/мл кількість життєздатних клітин становила 50% від загального числа клітин, а при концентрації 500 мкг/мл - 70%. Амізон у концентрації 200 мкг/мл виявляв незначну цитотоксичну дію, кількість нежиттєздатних клітин становила менше 10%. У нижчих концентраціях цитотоксичної дії препарату не спостерігалось. Цитотоксична доза (СD50), яка зменшувала кількість життєздатних клітин для амізону становила 800 мкг/мл.

Дію амізону на синтез ДНК клітин ФЛЕЛ з використанням методу мічення клітинної ДНК, досліджували в концентраціях 1 мкг/мл, 10 мкг/мл, 100 мкг/мл, 800 мкг/мл та 1000 мкг/мл (рис. 9). Підрахунок клітин, що містили ³Н-ТД-мітку, показав, що у культурі, не обробленій амізоном, через добу 30% клітин перебували у стадії синтезу ДНК. У процесі культивування кількість мічених клітин у контрольній культурі поступово знижувалась. Через три доби їх кількість становила 12%. У культурі, обробленій амізоном у концентраціях від 1 мкг/мл до 10 мкг/мл, число клітин, що містили ³Н-ТД-мітку, через добу культивування незначно відрізнялось від контролю. При концентраціях препарату 100 мкг/мл та 800 мкг/мл число мічених клітин щодо контролю становило 60% і 30% відповідно. Через три доби число клітин, що синтезують ДНК, знизилось щодо контрольної популяції на 50% у присутності 100 мкг/мл амізону, при концентрації 800 мкг/мл на 100%. Таким чином, отримані дані показали, що на 3-ю добу 50% зниження числа клітин, що синтезують ДНК (CD50), відбувається при концентрації амізону 100 мкг/мл.

Крім того, вивчали приріст клітин у контрольній і дослідній культурах. Для цього проводили підрахунок числа клітин на одиницю площі. Через три доби культивування відбувалося зменшення числа клітин на 50% щодо контрольної популяції при концентрації амізону 100 мкг/мл. Таким чином, концентрація препарату, що пригнічувала синтез ДНК на 50% та інгібувала приріст клітин на 50% для амізону складала 100 мкг/мл, виявилася значно нижче концентрації, що впливала на життєздатність клітин – 800 мкг/мл.

Дослідження анти-ЦМВ активності амізону у терапевтичній схемі досліджували у концентраціях 10 мкг/мл, 5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 0,1 мкг/мл та при ІМ вірусу 0,001 БУО/кл та 0,0001 БУО/кл. Ні при одній із досліджуваних концентрацій амізону та інфекційній множинності вірусу препарат не виявляв інгібуючої активності відносно ЦМВ.

Дослідження впливу амізону на репродукції ЦМВ у профілактичній схемі було вивчено в присутності препарату у концентраціях 5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 0,05 мкг/мл, з ІМ вірусу 0,0001 БУО/кл й 0,001 БУО/кл (рис. 10). Присутність амізону у концентрації 5 мкг/мл при зараженні ЦМВ із ІМ 0,0001 БУО/кл приводила до пригнічення вірусоспецифічної ЦПД через 5 діб на 90%, з ІМ 0,001 БУО/кл - на 70%. Амізон у концентрації 1 мкг/мл інгібував здатність вірусу до утворення антигенвмісних включень при ІМ 0,0001 БУО/кл на 70%, при ІМ 0,001 БУО/кл на 40%. Зменшення цитопатичної дії ЦМВ із ІМ 0,0001 БУО/кл було виявлено при концентрації 0,1 мкг/мл на 60%, із ІМ 0,001 БУО/кл - на 40%. Амізон у концентрації 0,05 мкг/мл інгібував здатність вірусу до утворення антигенвмісних включень при ІМ 0,0001 БУО/кл на 40% та при ІМ 0,001 БУО/кл на 30%.

Вплив амізону на розвиток ЦМВІ у клітинах ФЛЕЛ було вивчено також при використанні накопичувальної профілактичної схеми (рис. 11). Для цього препарат у концентраціях сполуки 5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 0,05 мкг/мл та 0,001 мкг/мл тричі вносили у культуру клітин - за 48 год., за 24 год. і за 1 год. до внесення вірусу (ІМ 0,001 БУО/кл і 0,0001 БУО/кл). Дослідження концентрацій сполуки показало, що ефективна доза (ЕD50) зменшується до 10% при вивченні усіх концентрацій амізону у порівнянні із ЕD50 ЦМВ у звичайній профілактичній схемі.

Таким чином, вивчення антивірусної дії амізону показало, що препарат ефективно пригнічував розвиток ЦМВІ у культурі клітин при профілактичній схемі застосування. Було встановлено, що цитотоксична доза (CD₅₀), що відповідає концентрації амізону, при якій спостерігалося 50% інгібування ЦПД ЦМВ, із ІМ 0,001 БУО/кл становила 1 мкг/мл, а з ІМ 0,0001 БУО/кл - 0,1 мкг/мл, IS в залежності від інфекційної множинності складав 100 – 1000.

Результати дослідження дії амізону на синтез ЦМВ білків при ІМ 0,001 БУО/кл. показали, що протягом трьох діб спостереження число клітин, що містили білки р72 і рр 65 у культурі, попередньо обробленій амізоном, практично не відрізнялось як від контрольної популяції клітин, так і від культури, обробленої ганцикловіром. Кількість клітин, що містила структурний вірусний білок gВ, у контролі та у досліді вірогідно не відрізнялась протягом перших двох діб. Через три доби після зараження вірусний білок gВ у контрольній культурі був визначений у 2,5% клітин. У клітинах, оброблених амізоном, кількість клітин, що містили gВ, становила 0,5%. На п’яту добу після зараження спостерігалось найбільше розходження між контрольною і дослідною культурами у кількості клітин, зафарбованих МКА до gВ. Так, число клітин, що синтезують gВ у культурі, обробленій aмізоном, ганцикловіром і у контрольній культурах склало 3%, 1,8% і 10%, відповідно. Таким чином, на п’яту добу після зараження, під дією aмізону накопичення пізнього структурного білку gВ було знижено приблизно у 3 рази щодо контрольної популяції. Таким чином, амізон пригнічував синтез пізніх структурних білків, продукція яких залежить від реплікації вірусної ДНК.

ВИСНОВКИ

Характеристики

Список файлов реферата