91280 (679838), страница 2

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 2)

Антигенвмісні включення у клітинах ЦМВ виявляли методом імуноцитохімічного забарвлення (кількісний варіант), досліджуючи препарати лейкоцитів периферичної крові хворих, забарвлених МКА до рр65.

Антивірусну дію 6-azaC чи 2-ß-Д-рибофуранозил-5-аміно-1,2,4-триазин-3(2Н)-ОН (Інститут молекулярної біології і генетики НАН України) та амізону чи 4-(N-бензил)амінокарбоніл-1-метилпіридиній йодид (Інститут фармакології і токсикології АМН України) щодо ЦМВ вивчали за методичними рекомендаціями (Щербинська А.М., Дяченко Н.С., Рибалко С.Л. та інш., 2000 ). Як контрольний препарат застосовували ганцикловір “Roche” (Швейцарія). Антивірусні сполуки досліджували в системі in vitro у трьох схемах: 1. терапевтична (робочі концентрації вносились після 24 г. інфікування клітин); 2. профілактична (робочі концентраціях вносились за 24 год. до інфікування клітин); 3. профілактична накопичувальна (робочі концентрації вносились за 48, 24 та 1 год. до інфікування клітин). Отримані дані виражали графічно у вигляді дозозалежної кривої, за допомогою якої визначали 50% ефективну дозу (ЕD₅₀), що зменшує кількість сформованих включень у клітинах на 50%. В результаті проведених досліджень визначали цитотоксичну дозу (CD50), ефективну дозу (ED50) та індекс селективності (IS) досліджуваних сполук, який розраховували за формулою: ІS = CD50 / ED50.

Результати були оброблені статистично за допомогою ком’ютерної програми Microsoft Excel-2000.

Виявлення ранніх білків ЦМВ за допомогою методів експрес діагностики. На першому етапі досліджень виявляли антиген ЦМВ у 50 новонароджених та дітей раннього віку. Дослідження проводили двома методами – швидким культуральним та ІФА, використовуючи лейкоцитарні фракції та сироватки крові отримані від дітей. Відповідно до класифікації клінічних проявів ЦМВІ, немовлят було розділено на дві групи. До першої - віднесли 23 дитини з клінічними симптомами перинатального інфікування ЦМВІ. До другої групи віднесли 27 дітей, яким діагноз ЦМВІ неонатологами та педіатрами поставлено не було.

Визначення класів Ig показало, що 96+0,82% зразків сироваток крові дітей 1-ої групи містили IgG, у той час, як у дітей 2-ої групи вони були зафіксовані у 59+0,49% обстежених (рис. 1). Найбільшу зацікавленість представили результати виявлення анти-ЦМВ IgМ, які розглядались як показник початкової стадії або гострої форми інфекції. IgМ були виявлені в сироватках крові 17+0,47% дітей з клінічними ознаками та у 22+0,51% дітей без клінічних ознак ЦМВІ (p<0,05). Швидким культуральним методом у дітей першої групи антиген ЦМВ було виявлено у 17 осіб, що складало 74%. Тоді як у дітей другої групи антиген ЦМВ виявлено не було. Останнє свідчить про високий рівень безсимптомних форм цитомегаловірусної інфекції, і спостерігається навіть у її гострій формі.

Рис. 1. Виявлення маркерів ЦМВ ІФА та ШКМ у крові дітей раннього віку

Проведене нами порівняння результатів 2-х лабораторних методів, що використовувались для діагностики ЦМВІ у обох групах дітей раннього віку, показало, що у обстежених дітей 1-ої групи (з клінічними ознаками ЦМВІ) IgМ та антиген ЦМВ одночасно було виявленj швидким культуральним методом у 3-х випадках, що складало 13+0,47% (табл. 1). Наявність у сироватках дітей цієї групи імуноглобулінів класу G супроводжувалося виявленням антигену ЦМВ швидким культуральним методом у 15 дітей (65%). У дітей другої групи (без клінічних ознак ЦМВІ) IgM було виявлено у 6 осіб, що сладало 22+0,47%, а IgG у 12 осіб, що складало 59+0,49%, тоді як антиген ЦМВ швидким культуральним методом виявлено не було (табл. 2). Одночасно IgG та IgM у дітей 2-ої групи було виявлено у 4 осіб, що складало 15+0,81% від загальної кількості дітей у групі.

Таблиця 1

Порівняльне дослідження виявлення ЦМВ у крові немовлят та дітей раннього віку з клінічними проявами ЦМВІ ІФА та ШКМ

Примітки:

1. ^1,2 Значення позитивного результату вираховували згідно інструкції виробоника тест-системи;

2. *О/О – оптичні одиниці

Таблиця 2

Порівняльне дослідження виявлення ЦМВ у крові немовлят та дітей раннього віку без клінічних проявів ЦМВ-інфекції ІФА та ШКМ

№ п/п Лейко лейко них фракцій крові	Імуноферментний метод ELISa фірми “HUMAN”		Швидкий культуральний метод
	Anti-CMV/Ig G	Anti-CMV/Ig М	p72 + pp65
	середнє значення оптичної густини *(ОО), (M+m)	середнє значення оптичної густини *(ОО), (M+m)	кількість антиген-вмісних клітин на 2х105 клітин ФЛЕЛ
1	0,397+0,01	0,190+0,006	0
2	0,36 +0,01	0	0
3	0,340+0,01	0	0
4	0	0	0
5	0	0	0
6	0	0	0
7	0,650+0,02	0	0
8	0	0	0
9	0,620+0,02	0	0
10	0,556+0,016	0,345+0,01	0
11	1,403+0,04	0	0
12	0,335+0,01	0	0
13	0,316+0,01	0	0
14	0,637+0,019	0,340+0,01	0
15	2,098+0,06	0,440+0,01	0
16	0,868+0,03	0	0
17	0	0	0
18	0	0	0
19	0	0,550 +0,02	0
20	0	0	0
21	0	0	0
22	0,516+0,02	0	0
23	1,570+0,05	0	0
24	2,445+0,07	0	0
25	0	0	0
26	0,699+0,02	0	0
27	0	0,300+0,009	0
Позитивний результат	1>0,250 ОО	2>0,250 ОО	> 1 клітини

Примітки:

1. ^1,2 Значення позитивного результату вираховували згідно інструкції виробоника тест-системи;

2. *О/О – оптичні одиниці

Підсумовуючи отримані дані можна заключити, що метод ІФА для визначення анти-ЦМВ АТ не є надійним методом для діагностики ЦМВІ у немовлят і дітей раннього віку; швидкий культуральний метод у 65% немовлят та дітей раннього віку виявляє ранні білки ЦМВ, що підтверджує гостру форму ЦМВІ.

Детекція раннього білку рр 65 ЦМВ у тесті на виявлення антигенемії. Наступним етапом нашої роботи було адаптувати та застосувати експрес-тест на виявлення антигенемії у клітинах крові людини та порівняти ефективність даного методу з ШКМ та методом ПЛР.

Проведена нами адаптація даного тесту, на відміну від відомого “Clonab CMV HCMV pp 65-Antigen” фірми Biotest (Німеччина), ґрунтувалась на виявленні раннього антигену у лейкоцитах крові людини за допомогою оригінальних моноклональних антитіл та спрямована на спрощення, прискорення і здешевлення даної методики. У результаті проведених досліджень, нами було запропоновано:

• застосовувати предметні скельця з полілізиновим покриттям (найбільш ефективні для отримання препаратів розпластаних клітин);

• використовувати оптимальну концентрацію лейкоцитів 2х10⁵ на препарат при об’ємі суспензії 0,20 – 0,25 мл;

• ефективним режимом для цитоцентрифугування є – 1500 об/хв, 7 хв;

• оптимальна концентрація оригінальних очищених моноклональних антитіл, для ефективного та специфічного застосування повинна складати - 1: 100.

У результаті запропонованих змін в тесті зберігалась більша кількість морфологічно цілих лейкоцитів, а комплекс АГ-АТ, що виявлявся за допомогою методу пероксидазного зафарбування, мав чіткий колір та контури.

Для дослідження діагностичної ефективності тесту на виявлення антигенемії ми відібрали групу хворих, що складалась із 17 пацієнтів після трансплантації нирки. Лiмфоцитарні фракції та сироватки хворих досліджували на наявність вірусних антигенів трьома методами: за допомогою тесту на виявлення антигенемії, швидкого культурального методу та полімеразної ланцюгової реакції (табл. 3). Досліди проводились у трьох повторах.

При порівнянні отриманих результатів встановлено, що методом ПЛР (якісний) у всіх 17-ти пацієнтів (100%) було виявлено ДНК ЦМВ (рис. 2). Дослідження лейкоцитів цієї групи хворих швидким культуральним методом виявило, що у 12 хворих (70%) було виявлено антиген ЦМВ, за допомогою тесту на виявлення антигенемії у лiмфоцитах крові, наявність раннього білку рр65 до ЦМВ було показано у 5-ти хворих (30%), при чому ці хворі мали клінічно виражені симптоми ЦМВІ і знаходились на гемодіалізі. Ідентичність результатів, отриманих ШКМ та у тесті на виявлення антигенемії спостерігалась у 10 хворих (59%) із них 5 позитивних та 5 негативних (рис. 3).

Таблиця 3

Порівняння результатів виявлення маркерів ЦМВ у крові паціентів після трансплантації нирки методами: тАГ, ШКМ та ПЛР

Примітка:

Характеристики

Список файлов реферата