90906 (679558), страница 3

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 3)

Здатність ДМАЦ у досліджених концентраціях суттєво пригнічувати активність ЛДГ та Г6ФДГ, ускладнила аналіз даних, отриманих за даним тестом. Оцінка ступеня пошкодження тромбоцитів за активністю цитозольних ферментів у позаклітинному середовищі виявилася прийнятною при порівнянні ефективності програм заморожування за умови використання одного кріопротектора, або кріопротекторів різних хімічних класів, які не впливають на активність зазначених ферментів. За даним тестом ефективність кріоконсервування за програмою з ініціацією кристалізації є вищою, ніж за програмою без ініціації кристалізації при застосуванні всіх досліджуваних кріопротекторів і їх комбінацій (рис. 8). Кріоконсервування з ДМСО має результатом менший ступінь пошкодження, ніж кріоконсервування з 1,2-ПД та 0,35 М комбінацією ДМАЦ з 1,2-ПД.

Вперше для оцінки кріоконсервованих тромбоцитів нами був застосований метод люмінесцентної мікроскопії з використанням АО. Найбільша кількість акридин-негативних форм спостерігалася після кріоконсервування з ДМАЦ та 1,2-ПД (відповідно 53 ± 6 % та 49 ± 8 %). Не виявлено достовірних відмінностей між вмістом акридин-позитивних і гранулярних тромбоцитів після кріоконсервування з ДМСО (відповідно 67 ± 8 % і 29 ± 4 %) та комбінаціями ДМАЦ з 1,2-ПД (відповідно 0,7 М: 47 ± 4 % і 14 ± 5,6 %; 0,35 М: 57 ± 4 % і 25 ± 6,5 %). Слід зазначити, що КТ, заморожені без кріопротектора за програмою №2 з температурною ініціацією кристалізації за субпопуляційний складом займали проміжне положення між КТ, кріоконсервованими з ДМАЦ і 1,2-ПД з одного боку та КТ, кріоконсервованими з ДМСО і комбінаціями ДМАЦ з 1,2-ПД з іншого: акридин-позитивних – 55 ± 5,6 %, гранулярних – 20 ± 5 %. Заморожування КТ без кріопротектора за програмою №2 з температурною ініціацією кристалізації мало результатом значно вищий вміст акридин-позитивних та нижчий – акридин-негативних тромбоцитів порівняно із заморожуванням за лінійною програмою №1.

Аналіз результатів дослідження кріопротекторної активності обраних органічних сполук показав, що за показниками структурної цілісності та функціональних властивостей тромбоцитів застосування комбінації ДМАЦ з 1,2-ПД підвищує ефективність кріоконсервування тромбоцитів порівняно із застосуванням кожного з кріопротекторів окремо. Отримані дані дозволяють рекомендувати дану комбінацію кріопротекторів у якості основи кріозахисного середовища при розробці технології низькотемпературного консервування тромбоцитів для клінічного застосування.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі проведено теоретичне узагальнення проблеми низькотемпературного консервування тромбоцитів крові людини і експериментально обґрунтований новий підхід до її вирішення. На основі дослідження впливу ряду факторів кріоконсервування на показники структурної цілісності і функціональних властивостей тромбоцитів визначені умови підвищення збереженості їх життєздатності та гемостатичного потенціалу на етапах низькотемпературного консервування.

1. Встановлено, що композиційний склад кріозахисного середовища і швидкість охолодження суспензії клітин в температурному інтервалі кристалізації та зоні евтектичних температур мають визначальний вплив на параметри структурної цілісності та функціональні властивості кріоконсервованих тромбоцитів (агрегаційна здатність, реакція на гіпотонічний шок, здатність до накопичення флуорохрому, активність цитозольних ферментів у позаклітинному середовищі). Вперше експериментально доведена доцільність використання комбінацій кріопротекторів у складі кріозахисного розчину при кріоконсервуванні тромбоцитів.

2. Показано важливе значення ступеня активації тромбоцитів на етапі виділення з донорської крові: концентрати тромбоцитів, отримані з лейко-тромбоцитарного шару, характеризувалися за всіма досліджуваними параметрами нижчим ступенем активації і виявили вищий рівень збереженості морфофункціональних властивостей до і після кріоконсервування порівняно з концентратами тромбоцитів, отриманими із збагаченої тромбоцитами плазми.

3. Встановлено, що всім дослідженим кріопротекторам притаманна антирадикальна активність. За здатністю перехоплювати гідроксильні радикали у модельній системі їх генерації кріопротектори розташувалися у порядку зростання: гліцерин < диметилацетамід < оксиетильований гліцерин зі ступенем полімеризації 5 ≈ 1,2-пропандіол < диметилсульфоксид.

4. Характер впливу кріопротекторів на інтенсивність перекисного окислення ліпідів у системі “тромбоцити-плазма” залежить від їх хімічної природи та концентрації. З ряду досліджених кріозахисних сполук 1,2-пропандіол та диметилацетамід у кінцевій концентрації 0,7 М суттєво не впливають на рівень пероксидації ліпідів, навіть за умови індукції іонами заліза. Не виявлено залежності між здатністю кріопротекторів до перехоплення гідроксильних радикалів в модельній системі та характером їх впливу на процеси перекисного окислення ліпідів в системі “тромбоцити-плазма”.

5. Експозиція тромбоцитів протягом 30 хвилин з диметилсульфоксидом, диметилацетамідом та 1,2-пропандіолом у кінцевій концентрації 0,7 М, за умов мінімізації осмотичного та механічного стресу при введенні та видаленні кріопротекторів розробленим способом [Пат. №15014 Україна, 2006], не викликає значних змін їх морфофункціонального стану. З підвищенням концентрації кріопротекторів до 1,4 М виявляються ознаки активації, порушення агрегаційних та осморегуляторних властивостей тромбоцитів.

6. Встановлена залежність збереженості структурної цілісності та функціональних властивостей тромбоцитів від швидкості охолодження у температурному інтервалі кристалізації (від 0/-1,5 до -35…-40 єC). Значення фактору швидкості охолодження в даному температурному інтервалі зростає зі зменшенням вмісту кріопротектора у складі кріозахисного середовища, а особливо – за його відсутності. Процедура температурної ініціації кристалізації сприяла підвищенню ефективності кріоконсервування концентратів тромбоцитів лише за умови наступного застосування певної контрольованої швидкості охолодження. Розроблена програма заморожування концентратів тромбоцитів, яка передбачає процедуру температурної ініціації кристалізації з подальшим охолодженням зі швидкістю 6 – 7 °С/хв в даному температурному інтервалі.

7. Експериментально доведена важливість застосування контрольованої швидкості охолодження в зоні евтектичних температур (від -35…-40 до -80 єC). Порівняльний аналіз результатів кріоконсервування концентратів тромбоцитів з диметилсульфоксидом виявив залежність ступеня пошкодження тромбоцитів від швидкості охолодження в даному температурному інтервалі: спостерігалася тенденція до підвищення збереженості тромбоцитів при охолодженні із швидкістю 25 – 30 єC/хв у порівнянні із швидкостями 0,5 – 1 °С/хв, 5 – 7 °С/хв, 10 – 15 °С/хв та достовірні відмінності у порівнянні зі швидкістю, що реалізується при прямому зануренні в рідкий азот.

8. Заморожування тромбоцитів за розробленою програмою у середовищі, що містить комбінацію диметилацетаміду з 1,2-пропандіолом у кінцевій концентрації 0,7 М, підвищує рівень збереженості структурної цілісності і функціональних властивостей тромбоцитів після кріоконсервування порівняно із застосуванням кожного з кріопротекторів окремо.

9. Експериментально визначені умови підвищення ефективності кріоконсервування концентратів тромбоцитів людини є реальною основою подальшої розробки і впровадження в роботу низькотемпературних банків крові технології їх довгострокового низькотемпературного зберігання для використання у практичній медицині.

ПЕРЕЛІК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Компанієць А.М., Книш О.В., Гуріна Т.М., Богданчикова О.А., Овсянніков С.Є., Погребняк М.Л. Дослідження морфофункціональної збереженості тромбоцитів на етапах кріоконсервування // Проблемы криобиологии. – 2006. – Т. 16, № 2. – С. 182 – 191.

2. Книш О.В., Овсянніков С.Є., Нікітченко Ю.В., Компанієць А.М. Дослідження антирадикальних властивостей кріопротекторів та їх впливу на інтенсивність ПОЛ у системі “тромбоцити-плазма” // Медична хімія. – 2006. – Т. 8, № 3. – С. 25 – 28.

3. Книш О.В., Гуріна Т.М., Богданчикова О.А., Овсянніков С.Є., Нікітченко Ю.В., Компанієць А.М. Вплив кінетики охолодження на результати кріоконсервування тромбоцитів крові людини // Міжвідомчий збірник “Гематологія і переливання крові”, випуск 33. – К.: Нора-друк, 2006. – С. 113–118.

4. Книш О.В. Вплив вихідного морфофункціонального стану тромбоцитів на результати їх кріоконсервування // Актуальні проблеми сучасної медицини. Вісник Української медичної стоматологічної академії. – 2007. – Т. 7, випуск 3 (19). – С. 170 – 173.

5. Пат. № 15014 Україна, МПК8 А0N 1/02. Спосіб видалення кріопротектора із суспензії тромбоцитів / Грищенко В.І., Компанієць А.М., Книш О.В. / Заявл. 18.11.05; Опубл. 15.06.06, Бюл. № 6.

6. Овсянников С.Е., Кныш О.В., Никитченко Ю.В., Компаниец А.М. Исследование антиоксидантных свойств криопротекторов различных классов химических соединений // Сборник трудов “Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека”. – Смоленск, Россия, 2005. – С. 366 – 368.

7. Книш О.В., Овсянніков С.Є., Компанієць А.М. Дослідження впливу кріопротекторів на рівень спонтанного та індукованого іонами заліза ПОЛ у системі тромбоцити-плазма-кріопротектор // Український біохімічний журнал. – 2005. – Т. 77, № 5. – С. 143.

8. Книш О.В., Овсянніков С.Є., Компанієць А.М. Порівняльна характеристика антирадикальних властивостей кріопротекторів у системах: модельній та “тромбоцити-плазма” // Проблемы криобиологии. – 2005. – Т. 15, № 4. – С. 740 – 741.

9. Овсянников С.Е., Кныш О.В., Линник Т.П., Компаниец А.М. Зависимость антирадикальной активности криопротекторов ряда полиолов и их оксиэтильных производных от химической структуры // Збірник матеріалів ІХ Українського біохімічного з’їзду. – Харків, 2006. – Т. 1. – С. 156 – 157.

АНОТАЦІЇ

Книш О.В. Дослідження впливу факторів кріоконсервування на морфофункціональні властивості тромбоцитів людини. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.35 – кріомедицина. – Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2008.

Дисертація присвячена вивченню впливу ряду факторів кріоконсервування на структурну цілісність та функціональні властивості тромбоцитів крові людини на етапах низькотемпературного консервування. Досліджено здатність кріопротекторів різних класів хімічних сполук перехоплювати гідроксильні радикали у модельній системі їх генерації та впливати на інтенсивність процесів ПОЛ у системі “тромбоцити-плазма”. Показано, що вихідний морфофункціональний стан тромбоцитів, композиційний склад кріозахисного середовища і швидкість охолодження суспензії клітин в температурному інтервалі кристалізації та зоні евтектичних температур мають визначальний вплив на параметри структурної цілісності та функціональні властивості кріоконсервованих тромбоцитів. Вперше експериментально доведено, що застосування комбінації ДМАЦ з 1,2-ПД підвищує ефективність кріоконсервування тромбоцитів порівняно із застосуванням кожного з кріопротекторів окремо. Встановлена можливість ефективного кріоконсервування концентратів тромбоцитів, виділених з лейко-тромбоцитарного шару, які зберігалися упродовж 18 – 24 годин при температурі 22 ± 2 єС.

Ключові слова: тромбоцити, кріоконсервування, кріопротектори, ПОЛ, програми заморожування.

Аннотация

Кныш О.В. Влияние факторов криоконсервирования на морфофункциональные свойства тромбоцитов человека. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.35 – криомедицина. – Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2008.

Диссертационная работа посвящена изучению влияния ряда факторов криоконсервирования на структурную целостность и функциональные свойства тромбоцитов крови человека на этапах низкотемпературного консервирования. Показана зависимость сохранности структуры и функций криоконсервированных тромбоцитов от степени активации/травматизации на этапе выделения КТ из донорской крови. Выделение КТ методом из лейко-тромбоцитарного слоя вызывает меньшую активацию тромбоцитов, что подтверждается более низким содержанием в концентрате активированных форм и агрегатов, менее выраженной микровезикуляцией и высокими показателями гранулярности тромбоцитов по сравнению с КТ, выделенными методом из обогащенной тромбоцитами плазмы. Результатом менее выраженной активации тромбоцитов на этапе выделения явился более высокий уровень сохранности их структурной целостности и функциональных свойств после криоконсервирования.

В сравнительном аспекте исследованы антирадикальные свойства криопротекторов, принадлежащих к различным классам химических соединений, по их способности к перехвату гидроксильных радикалов в модельной системе. Показано, что способность криопротекторов влиять на процессы ПОЛ в системе “тромбоциты-плазма” определяется их химической структурой и концентрацией. Не обнаружено зависимости между антирадикальной активностью криопротекторов в модельной системе и характером их влияния на процессы ПОЛ в системе “тромбоциты-плазма”.

Выделены факторы, которые имеют определяющее значение для результатов криоконсервирования тромбоцитов – состав криозащитной среды и скорость охлаждения криобиологической системы в интервале кристаллизации и зоне эвтектических температур. Теоретически обоснована и экспериментально разработана программа замораживания КТ с оптимальными скоростями прохождения температурного интервала кристаллизации. Показано, что большое значение для результатов криоконсервирования имеет также контролируемая скорость охлаждения КТ в зоне эвтектических температур.

Впервые экспериментально установлена целесообразность применения при замораживании тромбоцитов комбинации ДМАЦ и 1,2-ПД. Использование данной комбинации криопротекторов в конечной концентрации 0,7 М и разработанной программы замораживания позволяет значительно повысить уровень сохранности структурной целостности и функциональных свойств криоконсервированных тромбоцитов по сравнению с использованием каждого из криопротекторов отдельно.

Разработан новый способ максимального удаления криопротекторов из суспензии тромбоцитов, обеспечивающий минимальную механическую и осмотическую нагрузку на кровяные пластинки.

Ключевые слова: тромбоциты, криоконсервирование, криопротекторы, ПОЛ, программы замораживания.

ANNOTATION

Knysh O.V. Effect of cryopreservation factors on morphofunctional properties of human platelets. – Manuscript.

Характеристики

Список файлов реферата