ssa-010 (677566), страница 4

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 4)

Рис. Пример иммуноблотинга

Разумеется, если антиген необратимо денатурируется ДСН, то такая методика использоваться не может. Если белки антисывороткк разделить изоэлектрофокусированием, а затем перенести (это и называется блоттингом) на мембрану, то с помощью меченого антигена можно установить и так называемый спектротип антисыворотки, т.е. определить изотип антител, взаимодействующих с данным антигеном.

Схема: Основные методы окраски в иммуноблотинге (Western-blot).

Гель с исследуемым образцом после электрофореза

Перенос разделенных белков на мембрану

Определение белков

Определение антигена

Аннионые красители

Биотиновые плашки для блоттинга

Красители из коллоидного золота

Амидо черный или кумаси синий (R-250)

4- хлоро - 1 -нафтол (4CN)

Усиление окраски

Блок неспецифических мест связывания

Инкубация со специфическими антителами

Инкубация с реагентом

Коньюгаты пероксидазы хрена

Коньюгаты золота

Коньюгаты щелочной фосфатазы

Коньюгаты биотина, стрептовидин

4хлоро-1-нафтол, 3,3’-диамино- бензидин (DAB)

Усиление

окраски

Хемилюминесцентное определение

5-бромо-4-хлоро-3-индол фосфат (BCIP),

нитросиний тетразоль (NBT)

КРИТЕРИИ ПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ И ОТРИЦАТЕЛЬНЫХ РЕАКЦИЙ В ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Проблема дифференциации положительного и отрицательного результата не является специфической для медицины, а пути ее разрешения лежат в области математической статистики. Тем не менее, следует обсудить некоторые практические вопросы, с которыми встречаются врачи при использовании различных методов лабораторной диагностики, в том числе - иммунохимического анализа при инфекционных заболеваниях.

Основным противоречием, возникающим при анализе лабораторных данных и приводящим к совершенствованию известных и разработке новых методов диагностики, является несоответствие между целью медицинской диагностики как таковой, т. е. стремлением врача определить, чем болен пациент и целью того или иного метода (установление какого-либо параметра внутренней среды организма). Поэтому любой метод иммунохимического анализа должен рассматриваться лишь как часть общей диагностической процедуры. Ни один из этих методов не может быть использован вне клинической интерпретации. Ложноположительные или ложноотрицательные выя реакции при лабораторном анализе имеют значение не только для самого пациента. Такая ситуация при СПИДе, например, оказалась опасной и в социальном и в эпидемиологическом аспекте.

В лабораторном анализе при характеристике аналитической процедуры принято указывать количественные показатели метода: чувствительность, воспроизводимость, точность и др. Однако при определенных взаимодействиях между организмом и инфекционным агентом может возникнуть ситуация, когда высокочувствительный метод не позволяет получить достоверную информацию о причине заболевания. Например, определение антител любыми совершенными методами не дает информацию в случае выраженной иммуносупрессии гуморального ответа.

Для того, чтобы выразить возможность использования симптома (результата иммунохимического анализа) для диагностики определенного заболевания можно определить понятия чувствительности и специфичности анализа, в сравнении с контрольной группой здоровых людей, как частоту положительных и отрицательных реакций.

число положительных реакций у больных с подтвержденным диагнозом

Чувствительность=---------------------------------------------------------------------

число обследованных больных с подтвержденным диагнозом

число отрицательных реакций в контрольной группе

Специфичность = -------------------------------------------------------------------------

число обследованных пациентов в контрольной группе

Эти параметры могут быть использованы при сравнении эффективности каких-либо методов. Однако для применения их на практике необходимо уточнить принципы формирования опытной и контрольной групп, а также оценить, какое значение имеют вычисленные параметры для оценки случайно выбранных неизвестных образцов. Правильное решение указанных вопросов и позволяет перейти к разработке критериев положительной и отрицательной реакции.

Для формирования опытной группы больных с инфекционной патологией, как правило, используют больных, у которых обнаружен искомый инфекционный агент другими методами - бактериологическими, вирусологическими и т. п. В случае инфекции, вызываемой условнопатогенными микроорганизмами используют количественные или функциональные критерии. В зависимости от целей анализа, группа может быть более или менее однородной по другим признакам данного заболевания - особенностям течения и тяжести инфекционного процесса, возрасту больных, сопутствующему лечению (прежде всего - введению антибиотиков).

Формирование контрольной группы из здоровых лиц является наиболее частым, но не единственным способом. Если анализируемый метод будет применен для дифференциального анализа _ сходных заболеваний, вызываемых разными микроорганизмами, более важным является подбор группы с заболеванием, которое следует исключить при установлении диагноза. Например, при острой пневмонии, вызванной различными возбудителями (Str. Pneumoniae, H. influenzae) для оценки чувствительности и специфичности, например, метода определения антигенов пневмококка, следует сформировать контрольную группу из больных с заболеванием, вызванным гемофильной палочкой. Вышеуказанное важно учитывать при разработке методов диагностики. Однако и при использовании этих методов следует иметь представление о причинах возникновения и возможной интерпретации ложноположительных и ложноотрицательных реакций. При анализе образцов от пациентов с неизвестным диагнозом следует учитывать дополнительные параметры, производные от чувствительности и специфичности анализа.

Ожидаемая ценность Число положительных результатов в опытной группе

положительного =-------------------------------------------------------------------

результата Число положительных результатов в обеих группах

Ожидаемая ценность Число отрицательных результатов в опытной группе

отрицательного =-------------------------------------------------------------------

результата Число отрицательных результатов в обеих группах

В целом, чем выше чувствительность и специфичность анализа, тем выше ценность положительного и отрицательного результатов. Однако для случайно взятых образцов значение ожидаемой ценности результатов будет зависеть от частоты данного заболевания в популяции (преваленс). Например, при чувствительности и специфичности метода равных 99% и частоте заболевания 0,1% количество больных на 100 000 пациентов составит 100, из них положительная реакция будет у 99. Однако у пациентов без данного заболевания (всего их 99 900) будет в 100 случаях также выявлена положительная реакция. Таким образом, ценность положительного результата составит 99/(100+99) 50%, а отрицательного - 99 80ОД99 800+1) 100%. В случае же, если в данной популяции частота заболевания более высока, то и ценность положительного результата выше. Например, при частоте в 10%, соответствующие значения ценности положительного результата - 91,70/0, а отрицательного - 99,9%.

Влияет ли выбор критерия оценки положительного и отрицательного результата на чувствительность и специфичность анализа?

При оценке того или иного метода диагностики врач, как правило, пользуется критериями, специально выработанными для данного метода, реже - собственным опытом. В качестве критерия установления положительного или отрицательного результата может выступать параметр в виде концентрации вещества (в сравнении с концентрацией в норме). Могут быть использованы безразмерные величины, выражающие отношение определяемого показателя к нормальной величине. Иногда критерием служат единицы активности материала и характеристики активности специально введенных меченых молекул (флуохромы, изотопы и т. п.).

Наиболее часто определение критерия положительной реакции связано с анализом образцов из опытной и контрольной групп, описанных выше. Определение значений чувствительности и специфичности при разных способах оценки позволяет выявить критерий, соответствующий максимальному значению вычисленных величин.

Принципиальное значение для определения этих критериев имеет аналитическая вариабельность метода, т. е. величина расхождения между значениями, полученными при многократных измерениях одной и той же пробы. Допускается, что этот параметр должен составить не более 10% среднего значения измеряемой величины, но не больше 25% ширины интервала величин, полученных в контрольной группе [Власов В. В., 1988].

Большое разнообразие методов и реакций, применяемых в иммунохимическом анализе отражает различия в течениии инфекционных процессов, многообразие возбудителей и условий взаимодействия между микро- и макроорганизмом. Но также, как не может существовать единственного средства лечения всех болезней, нет панацеи и в диагностическом смысле.

Итак, проведение аналитических процедур при подозрении на инфекционное заболевание, должно быть направлено на обнаружение патогенного агента (вируса, бактерии, простейшего и т. п.), а также иммунологического ответа макроорганизма на этот агент. Классическая триада Коха в подавляющем большинстве случаев является недостижимым условием диагностики вирусных и бактериальных заболеваний, в меньшей степени - паразитарных. Многочисленные исследования бессимптомного носительства вирусов и бактерий убеждают в том, что обнаружение микроба является лишь одним из признаков, которые должны учитываться врачом при постановке диагноза. Ситуацию осложняют частые смешанные инфекции (ассоциации типа вирус - вирус, бактерия - бактерия и вирус - бактерия). Кроме того, иммунный ответ на инфекционный агент не во всех случаях носит регулярный характер (первичные и вторичные иммунодефициты). С другой стороны, современный человек иммунизируется достаточно большим количеством вакцин, что может маскировать развитие сопутствующей инфекции. В связи с этим, процесс установления диагноза, в том числе с помощью иммунохимических методов, следует рассматривать как вероятностный. Привлечение дополнительной информации (расширение симптоматики) можно считать способом увеличения вероятности установления правильного диагноза. Для инфекционных заболеваний, несмотря на конкретный тип или вид возбудителя, можно назвать три основных процесса, которые определяют вероятность идентификации этиологического агента:

- наличие в макроорганизме или на ограничивающих его покровах генетического материала микроорганизма, продукты которого прямо или опосредовано повреждают функциональные структуры макроорганизма;

- определение в макроорганизме или на ограничивающих его покровах этих биологически активных продуктов микроорганизма, приводящих к проявлению симптомов, характерных для данного заболевания;

- изменение состояния иммунной системы макроорганизма под действием микробных продуктов, направленное на их нейтрализацию.

Очевидно, что ни один из этих признаков не выявляется в 100% случаях в любой стадии и разновидности инфекции определенного типа. Так, на стадии выздоровления сами микробы и многие их продукты могут не определяться. Иногда развернутая клиническая картина является следствием воздействия на макроорганизм микроба, который быстро элиминируется из организма. При этом, в одних случаях невозможно достоверно определить генетический материал микроба, а в других - уже нейтрализованный антигенный материал. Иммунный ответ, как уже отмечалось выше, может развиваться лишь через несколько суток после начала болезни. Следовательно, в начальной стадии болезни определение, например, наличия антител затруднительно. Но тем не менее наличие в течение определенного периода времени одного, двух или всех трех рассмотренных признаков пропорционально ведет к увеличению вероятности того, что данный микроб является возбудителем. И наоборот, если ни один их этих признаков не наблюдается, то эта вероятность стремится к нулю.

Рассматривая примеры использования различных методов для специфической диагностики инфекционных заболеваний можно отметить, что коммерческие препараты, используемые в мире для этих целей, относятся в основном к методам агглютинации, преципитации, нейтрализации вирусов, ингибирования гемагглютинации, пассивной гемагглютинации, коагглютинации, латексагглютинации, реакции связывания комплемента, иммунофлуоресценции, ИФА. Значительно реже для этих целей используют радиоиммунологический анализ, метод генного зондирования, а коммерческие иммуносенсоры и липосомальные методы еще только разрабатываются. Хотя в научной литературе есть сообщения о разных видах иммунохимического анализа, описанных или не упомянутых в настоящей главе, немногие методы стали общепринятыми.

Для бактериальных инфекций в некоторых случаях сохраняется использование методов прямой агглютинации бактерий для идентификации их чистой культуры (при респираторных, кишечных инфекциях) либо определение

Таблица: Возможности использования коммерческих препаратов для различных методов лабораторной диагностики при инфекциях у человека.

антител (кишечные инфекции), хотя значение этих реакций в сравнении с другими более чувствительными, постепенно снижается. Такая же закономерность наблюдается и при использовании методов прямой агглютинации при паразитарных заболеваниях.

Характеристики

Список файлов реферата