13426 (648126), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Основоположником микробиологического метода борьбы с вредными насекомыми является великий французский микробиолог Луи Пастер. В 1874 г. он предложил использовать энтомопатогенные бактерии для борьбы с опасным вредителем винограда филлоксерой. Через пять лет русский ученый И. И. Мечников применил гриб — возбудитель зеленой мускардины для уничтожения хлебного жука. Большой вклад в разработку микробиологического метода борьбы с вредными насекомыми внес канадский исследователь Ф. д'Эррель. Им были выделены культуры неспороносной бактерии и использованы для борьбы с саранчой в некоторых странах Южной Америки и Северной Африки. Большое количество энтомопатогенных форм спорообразующих бактерий было выявлено и изучено в 1922—1942 гг. советскими учеными. Некоторые из этих форм бактерий стали использоваться в производстве инсектицидных препаратов, уничтожающих вредителей кукурузы, винограда и хлопчатника. В 1959—1960 гг. в СССР, США, Франции было организовано промышленное производство специальных бактериальных инсектицидов, содержащих споры Bacillus thuringiensis. В настоящее время микробные препараты заняли прочное место среди средств защиты растений от вредителей.
Микробиологические препараты нередко используются в комбинации с сублетальными дозировками химических инсектицидов. Сублетальные концентрации пестицидов не столь опасны для человека, как обычные дозы. Вместе с тем они ослабляют защитные силы вредных насекомых, делают их более восприимчивыми по отношению к инфекции.
Следует подчеркнуть, что использование микробных препаратов для борьбы с вредными насекомыми не представляет опасности для человека, поскольку возбудители болезней насекомых обладают высокой степенью специфичности. Кроме того, как правило, они не накапливаются в окружающей среде. Вместе с тем микробные инсектициды действуют медленнее, чем химические препараты и их эффективность в значительной степени зависит от условий среды. Кроме того, их следует вносить достаточно часто, чтобы препарат действовал на протяжении длительного времени. Причина этого недостатка — в высокой степени специализации энтомопатогенных микроорганизмов: гибель вредных насекомых влечет за собой отмирание самих микроорганизмов. Последний недостаток микробных инсектицидов может быть устранен с помощью методов генетической инженерии. Можно, например, ввести ген, обеспечивающий синтез токсических веществ в широко распространенные сапрофитные, обитающие на растениях бактерии. В этом случае колебания в численности вредных насекомых не будут отражаться на численности инсектицидных бактерий.
Вирусные болезни очень широко распространены среди насекомых. В связи с этим вирусные инсектициды являются эффективным средством защиты лесных насаждений и сельскохозяйственных культур от вредных насекомых. В России производятся вирусные инсектициды, предназначенные для борьбы с наиболее опасными вредителями сельского и лесного хозяйства: капустной, озимой и хлопковой совкой, непарным и кольчатым шелкопрядами, американской белой бабочкой, рыжим сосновым пилильщиком и яблонной плодожоркой.
Основным препятствием на пути широкого внедрения в практику вирусных препаратов является трудность культивирования вирусов как облигатных паразитов. Характерной особенностью их производства является размножение вирусов в живых клетках. Для получения вирусных инсектицидов используются соответствующие насекомые-вредители. Но насекомые, предназначенные для размножения вирусов, отнюдь не являются стерильными, они населены разнообразной микрофлорой, в том числе и вирусами. В связи с этим при производстве вирусных инсектицидов необходим строгий и постоянный контроль их, качества. Присутствие в насекомых посторонней микрофлоры приводит к снижению качества препаратов. Кроме того, в процессе производства этих препаратов приходится заражать вирусом большое количество насекомых, а затем извлекать его из массы погибших личинок. Все это сказывается на стоимости и качестве препарата.
В связи с отмеченными трудностями ученые задались целью выяснить, нельзя ли использовать для производства вирусов метод культуры клеток животных. Ведь преимущества этого метода очевидны: клетки могут быть избавлены от посторонней микрофлоры, они однородны, размножаются стабильно.
Первые попытки культивирования клеток насекомых были предприняты в начале XX в. Однако длительное время среди ученых было распространено мнение, что выращивание клеток беспозвоночных в культуре не имеет практического значения. По этой причине исследования в области культуры клеток насекомых велись недостаточно активно. Интенсивные исследования проблемы начались в 60-х годах, когда Т. Д. Грейс получил первые четыре перевиваемые линии из тканей яичников эвкалиптового шелкопряда. В 1976 г. уже насчитывалось более 120 перевиваемых линий клеток насекомых, а к 1983 г. их количество превысило 200.
Для получения клеточных линий используют первичные культуры эмбрионов, гомоцитов, яичников, имагинальных дисков, жировых тел, мацерированных личинок, куколок или имаго. Доказано, что личинки и куколки насекомых — лучшие источники получения культивируемых клеток. Методика получения первичных культур клеток насекомых достаточно отработана. Она включает следующие этапы:
-
стерилизация поверхности насекомых и подлежащих культивированию тканей;
-
диссоциация клеток;
-
пересадка их на питательную среду.
Срок жизни первичных клеточных культур ограничен. Через определенное время культура стареет, что проявляется в грануляции цитоплазмы, сморщивании и округлении клеток, потери связей между клетками и твердым субстратом. Усилия вирусологов направлены на получение стабильных клеточных линий, т. е. клеток, способных культивироваться на искусственных питательных средах до бесконечности. В настоящее время получены стабильные (перевиваемые) клеточные линии таких важных вредителей сельского и лесного хозяйства, как непарный шелкопряд, капустная металловидка, хлопковая и табачная совка и др.
Для нужд медицины и здравоохранения разработано заводское оборудование для массового производства клеток позвоночных животных in vitro. Эта технология, по мнению специалистов, может быть использована с небольшими модификациями и для культивирования клеток насекомых.
В настоящее время выпускается несколько препаратов, содержащих энтомопатогенные вирусы. Это прежде всего ряд отечественных препаратов типа вирин: вирин-ЭНШ против непарного шелкопряда, вирин-АББ против американской белой бабочки, вирин-ЭКС против капустной совки, вирин-ЯМ против яблоневой моли, вирин-КШ против кольчатого шелкопряда, вирин-ГЯП — против яблонной плодожорки, вирин-ХС против хлопковой совки и препарат элкар против совок из рода. Heliothis.
Наряду с вирусами для борьбы с вредными насекомыми используются бактерии. Наибольшее практическое значение в деле организации борьбы с насекомыми-вредителями имеет бактерия В. fburingiensis, она составляет основу "современной промышленности по производству бактериальных, инсектицидов. В. thuringiensis объединяет разновидности спорообразующих бактерий, вырабатывающих особые энтомоцидные токсины, обладающие высокой активностью по отношению к насекомым. Эти токсины могут быть двух видов: кристалловидный и растворимый.
Кристаллы первого типа имеют ромбовидную (тетрагональную) форму. Они обнаруживаются в клетках в процессе споруляции с помощью обычного светового микроскопа. Их часто называют параспоральными включениями или эндотоксинами. После завершения спорообразования кристаллы попадают в питательную среду, где обнаруживаются в свободном виде. По химической природе кристаллы представляют собой термолабильные белковые вещества, разрушаемые при температуре 60°. Бактерии, продуцирующие кристалловидный токсин, обитают среди микрофлоры кишечника различных насекомых. Выделенный из них токсин, будучи введен в гусениц чешуекрылых насекомых, вызывает паралич кишечника. Насекомые гибнут при обработке их растворами очень слабой концентрации— 1:106.
Некоторые разновидности В. thuringiensis образуют энтомоцидный низкомолекулярный токсин нуклеотидной природы, называемый экзотоксином, который в отличие от кристалловидного токсина находится в культуральной жидкости в растворенном состоянии и не разрушается при кипячении. В составе его имеются два родственных вещества, названные тюрингиензинами А и В. Экзотоксин отличается от кристалловидного токсина меньшей специфичностью — он активен по отношению ко многим видам насекомых. Препараты обоих токсинов безвредны для теплокровных животных, рыб и растений.
В нашей стране и за рубежом из В. thuringiensis в промышленных масштабах изготовляют ряд препаратов, предназначенных для борьбы с вредными насекомыми. Из зарубежных препаратов известны биотрол, турицид, агритрол, бактан, дипел, бактоспейн и др. Мировое производство препаратов из В. thuringiensis в 1979 г. составляло более 1200 т, что позволяет обработать площадь посевов в несколько миллионов гектаров.
В США инсектициды на основе В. thuringiensis производятся компанией «Сельскохозяйственные продукты Монсанто» («Monsanto. Agricultural Products»). Фермеры в течение двадцати лет используют эти препараты для защиты таких культур, как капуста, хлопчатник, бобы, картофель.
В Росии созданы, применяются или проходят испытание следующие препараты: дендробациллин, энтобактерин, инсектин, гомелин, битоксибациллин (БТБ-202), бактериальный инсектицидный препарат (БИП), алестин, туверин-2, лепидоцид, инсектин-2. Они поражают свыше 200 видов вредных насекомых. Промышленное изготовление бактериального препарата энтобактерина осуществляется в нашей стране еще с 1959 г.
Бактериальные инсектициды обычно выпускаются в виде порошка. Это удобная для транспортировки, хранения и использования форма. Против ряда вредителей, применяются гранулированные и инкапсулированные формы бактериальных препаратов. Так, например, для борьбы с кукурузным мотыльком успешно используются препараты, в гранулах с кукурузной мукой.
Для повышения эффективности бактериальных инсектицидов употребляются различные- добавки — растекатели, прилипатели. или распылители. Препараты содержат споры бактерий и кристаллы эндотоксина, а в некоторых случаях (препарат битоксибациллин) и термостабильныи токсин с помощью которого удается расширить спектр действия препаратов. Эти препараты можно комбинировать с сублетальными дозами химических инсектицидов, а именно некоторых карбаматов, фосфорорганических препаратов, пиретроидов, с препаратами энтомопатогенных вирусов, о которых говорилось выше. В нашей стране дендробациллин, энтобактерин, инсектин, гомелин, битоксибациллин используют в смеси с хлорофосом, золоном, фосфамидом, севином, бензофосфатом, фозолоном, метатионом, метафосом, полидофеном, рогором, карбофосом против непарного и кольчатого шелкопрядов, яблонной и капустной молей, плодожорок, боярышниковой и розанной листоверток, хлопковых и капустных совок, боярышницы, шелкопряда-монашенки, комплекса пядениц, дубовой листовертки, лугового мотылька, красногрудой пьявицы, бересклетовой и японской восковой ложнощитовок, шишковой огневки. Химические добавки вряде случаев повышают эффективность биопрепаратов на 20—30% или не изменяют ее. Причины отсутствия эффекта при добавлении к биопрепаратам ядохимикатов еще не выяснены, однако в целом ряде случаев отмечено отрицательное влияние химических добавок на жизнеспособность спор В. thuringiensis (в случае фосфорорганических инсектицидов, алдрина, гепта-хлора). Вместе с тем ряд препаратов оказался совместимым с бактериями. Эти препараты могут быть рекомендованы к использованию при осуществлении интегрированной защиты растений от вредных насекомых (ортен, дилокс, ланнот, цетран, димелин).
С целью повышения эффективности бактериальных препаратов пытаются использовать особые клеющие вещества. Производственную проверку успешно прошел прилипатель поливинилацетат идрожжевая бражка в концентрации 1 %. Добавление к препарату В. thuringiensis фермента хитиназы, ускоряющего гидролиз хитинового покрова насекомых, ускоряет гибель еловой листовертки. Помимо хитиназы хороший эффект дает димелин, который подавляе 'образование хитина у гусениц и удлиняет межлиночный период. Наряду с В. thuringiensis для борьбы с вредными насекомыми могут быть использованы и некоторые другие бактерии. Так, например, культуры В. popilliae являются эффективным средством борьбы с японским жуком — опасным вредителем, поражающим около 300 видов растений. Бактерия вызывает так называемую молочную болезнь вредителя. Для практических надобностей бактерии выращивают непосредственно в организме личинок японского жука. Погибших личинок вносят в почву, где споры бактерий в течение длительного времени сохраняют жизнеспособность и вирулентность. Детальное изучение биологических особенностей этих бактерий позволит успешно культивировать их на искусственных питательных средах и изготовлять бактериальные инсектициды в больших количествах. Они могут быть использованы для борьбы с вредными жуками и другими насекомыми, против которых ныне используемые средства малоэффективны.
Для производства инсектицидных препаратов применяются не только виды энтомопатогенных бактерий, изъятые из природы, но и микроорганизмы, созданные методами генетической инженерии. Ученые, сотрудничающие с компанией «Сельскохозяйственные продукты Монсанто» (США), разрабатывают проблему клонирования гена, контролирующего синтез токсичных для насекомых веществ и передачи этого гена бактерии Pseudomonas fluorescens — безвредному неспороносному флуоресцирующему микроорганизму, который широко встречается в почве, воде, на различных растительных и животных субстратах. Созданные методами генетической инженерии энтомопатогенные бактерии можно использовать путем заражения ими семян или почвы во время посева. В этом случае инфекция может оказаться действенной в течение длительного времени. Ведь микроорганизмы, созданные методами генетической инженерии, даже в случае гибели вредных насекомых будут сохраняться в природной среде как обычные сапрофиты.
Проведенные исследования показывают, что клонирование токсичных генов возможно. Микроорганизмы, созданные методами генетической инженерии, оказались способными поражать определенные виды вредителей растений.
В 1835 г. итальянский исследователь А. Басси впервые описал гриб из рода боверия, обнаруженный на гусеницах тутового шелкопряда. Гриб получил видовое название, образованное от фамилии первооткрывателя — боверия бассиана (Beauveria bassiana). Гусеницы тутового шелкопряда, пораженные этим грибом, были сморщенными, сухими, покрытыми белым налетом, что делало их похожими на засахаренные фрукты. По этой причине заболевание тутового шелкопряда получило название белая мускардина (от французского слова, означающего «засахаренный фрукт»). Позднее было обнаружено, что гриб поражает не только полезных насекомых, к числу которых относится тутовый шелкопряд, но и многочисленных вредителей (колорадский жук, картофельная коровка, луговой и кукурузный мотылек, сосновая пяденица, сосновая совка, вредная черепашка, яблонная и персиковая плодожорка, некоторые виды клещей). Боверия бассиана распространена очень широко. Она встречается всюду, где имеются насекомые, и поэтому по праву считается космополитом. Только в Северной Америке ею поражается свыше 175 видов насекомых. В нашей стране возбудитель белой мускардины вызывает заболевание более 60 видов насекомых. Насекомые и клещи, устойчивые к белой мускардине, способствуют распространению ее мицелия и спор. Другой представитель рода боверия — боверия тонкая (Б. tonella) поражает главным образом вредных жуков: западного и восточного майских хрущей.
Мускардиновые грибы способны к сапротрофному питанию и сравнительно легко культивируются на искусственных питательных средах. Правда, боверия тонкая несколько хуже растет в искусственных условиях, она требует присутствия в питательной среде витаминов. Боверия бассиана успешно размножается на ломтиках картофеля. Результаты сравнительного испытания гриба боверия бассиана в глубинной и поверхностной культурах показали, что в поверхностной культуре для его роста создаются более благоприятные условия. Состав питательной среды оказывает влияние на вирулентность гриба.
Еще в 60-х годах в Украинском институте защиты растений был изготовлен препарат боверин, представляющий собой порошок серого цвета, содержащий споры мускардиновых грибов В. bassiana и В. globalifera, а также наполнитель (каолин). Препарат был рекомендован в сочетании с сублетальными дозами ядохимикатов для борьбы с колорадским жуком, дубовой листоверткой и другими вредителями сельского и лесного хозяйства.