10073 (646297), страница 3

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 3)

Использование белкового сплайсинга для создания биосенсоров

После открытия того, что с помощью интеина можно биологически приемлемо сшить два разных белка, начались работы по созданию нового типа биосенсоров. Главной проблемой в этой области является сложность иммобилизации сенсорного белка на поверхности (т. е. покрытие им поверхности сенсора так, чтобы белок не утратил работоспособности). С помощью интеинов можно «сшивать» между собой два разных белка, один из которых может служить молекулярным якорем, связываясь с нужной поверхностью, а второй — самим сенсором. Так, например, с помощью такой технологии удалось сшить мальтоза-связывающий белок (МВР) и Т4 ДНК-лигазу. В результате активность Т4-лигазы сохранилась, а пришитый МВР позволяет её закрепить или очистить на поверхности биосенсора. Другая технология — протеомный микроанализ (protein microarray) — требует создания матриц, на которых были бы ковалентно пришиты определённые белки-маркёры. Проблема заключается в том, что, с точки зрения технологичности (т.е. простоты хранения, транспортировки и использования), белки должны быть пришиты ковалентно. При этом они, естественно, не должны терять активности (что проблематично, поскольку на твёрдых поверхностях белки часто слипаются и инактивируются) и не содержать примесей (которые могут искажать результаты). Поэтому интеины как посредники, которые могут нативно сшивать целевой белок с любой поверхностью, модифицированную каким-то образом (например, покрытую недорогим серосодержащим полимером), являются весьма ценным инструментом. Первые работы в этой области уже дали довольно хорошие результаты. Эти работы позволяют надеяться, что в ближайшем будущем мы получим мощный инструмент для анализа белок-белковых взаимодействий и картирования протеома организма — ведь это, как известно, следующая глобальная задача после картирования генома.

Циклизация ферментов

Такое трудно даже представить. Однако это осуществлено — белок «скрутили в баранку» без начала, без конца. Для этого был использован феномен транс-сплайсинга, только интеин-подобные N- и С- домены находились не в разных белках, а на разных концах одного белка. Методика, с помощью которой возможно циклизировать белки, получила название SICLOPPS (Split Intein-mediated Circular Ligation Of Peptide and ProteinS). Кстати, закольцованный таким способом фермент (со сложным названием дегидрофолатредуктаза), после этого не только не потерял своей активности, но даже наоборот — стал менее чувствительным к изменению температуры среды. А в промышленности, где из-за больших объемов температуру реакции контролировать намного сложнее, такие катализаторы будут очень востребованы.

Экспрессия токсичных для клетки продуктов

Часто эукариотические белки, экспрессируемые в клетках прокариот, убивают организм-продуцент. Это явление называется токсичностью. Из-за неё ряд практически важных белков (например, протеазы) в достаточных количествах наработать в бактериях не удается. Использование систем экспрессии на основе интеинов может решить эту проблему. Токсичные для клетки белки можно нарабатывать в виде неактивных химерных предшественников, слитых с интеинами. Последние нарушают структуру продукта и не дают ему активироваться. После наработки такие химерные белки очищаются и активируются путем индукции самоудаления интеина из их структуры.

Заключение

До сегодняшнего дня считается, что сплайсинг в живых клетках протекает непосредственно после трансляции. Это относится и к цис- и к транс-вариантам. Вероятно последним требуется какое то время для встречи и объединения ИПДоменов. Но в литературе отсутствуют данные о том, что в какой-либо клетке наблюдался пул белков с и без интеина - интеины обнаруживаются только после секвенирования генома.

В биотехнологии ситуация другая - в большинстве случаев именно требуются интеины, активностью которых можно было бы управлять. Это достигается заменой либо первого цистеина, либо последнего аспарагина на аланин. Кроме того, часто замена природных экстеинов на биотехнологические продукты уже тормозит активность интеина. Соответственно в обоих случаях мы можем выделить интеин-содержащий конструкт и потом активировать сплайсинг - чаще всего добавлением тиольных агентов, которые исполняют роль цистеина или серина.

Сплайсинг нуклеиновых кислот является одним из мощнейших способов быстрой перетасовки наследственной информации, что в некоторых случаях помогает живым организмам быстро приспособиться к изменившимся условиям. Поэтому его обнаружение у белков еще раз подтвердило универсальный для всего живого принцип «разумной бережливости» — удачные процессы, характерные для одних типов молекул, часто обнаруживаются и у других (в данном случае — и у нуклеиновых кислот, и у белков).

Механизмы белкового сплайсинга до сих пор до конца не изучены. И особенно это относится к возможным функциям интеинов в клетке. О том, что дают интеины клеткам, что с ними происходит после сплайсинга, как часто происходит явление сплайсинга или хоуминга — до сих пор не известно. Это дает широкое поле для исследований. Однако бесспорно одно — явление белкового сплайсинга дает еще бульшую гибкость и приспособляемость организмам, поскольку позволяет уже пост-трансляционно изменять продукт гена (или генов). Мы видим, что к известным, и без того изощрённым и многогранным, механизмам живой клетки добавляется еще один. И по всей вероятности — далеко не последний.

Список литературы

1.http://ru.wikipedia.org/wiki/Сплайсинг

2.http://ru.wikipedia.org/wiki/Сплайсосома#.D0.A1.D0.BF.D0.BB.D0.B0.D0.B9.D1.81.D0.B8.D0.BD.D0.B3_.D0.A0.D0.9D.D0.9A

3.http://ru.wikipedia.org/wiki/Сплайсинг_белков

4.Старокадомский П.Л. Теория и механизм сплайсинга//Молекулярная биология, Москва, 2007

5. Сплайсинг белков на сервере «Биология человека» (в интернете);

6. Старокадомский П. Л. Белковый сплайсинг // Молекулярная биология (Москва), 2007, том 41, № 2, c. 314–330. (в интернете);

7. Старокадомский П. Л. Белковый сплайсинг // Укр. биох. журн., 2005, № 4, с. 14–29;

8. Сайт «биомолекула»: «Геном человека: как это было и как это будет»;

9. Сайт «биомолекула»: «Белки против РНК: кто первым придумал сплайсинг?»

Характеристики

Список файлов реферата