10036 (646276), страница 3

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 3)

Для выделения чистых культур патогенных бактерий применяют оптимальные для их роста питательные среды с фиксированным рН. Большинство бактерий способно расти на различных питательных средах; исключение составляют хламидии и риккетсии, не растущие in vitro вне клеточных культур. Используемая среда должна содержать

-
вещества, утилизируемые бактериями для различных биосинтетических процессов.

Универсальные источники азота и углерода — бел- ковые гидролизаты (содержат полный набор аминокис- лот), пептиды и пептоны. Универсальные источники
витаминов и микроэлементов — экстракты белков жи-
вотного или растительного происхождения и белковые гидролизаты.

рН среды. В некоторых случаях жизнедеятельность
бактерий сопровождается сдвигом рН в кислую или
щелочную сторону, что требует внесения в среды раз-­
личных буферных систем (обычно применяют фосфат­-
ный буфер). Сбалансированные среды отличают высо­-
кая буферность и стабильный оптимум рН. Важно так­
же создание оптимальной концентрации О₂ и СО₂. ;

Классификации сред

Среды классифицируют по консистенции, составу, про­исхождению, назначению и загрязнённости материала.

По консистенции питательные среды разделяют на плотные (твёрдые), полужидкие и жидкие.

По составу выделяют белковые, безбелковые и ми­неральные среды.

По происхождению среды разделяют на искусствен­ные и естественные (природные).

Искусственные среды разделяют на животные [например, мясопептонный агар (МПА) или мясопептонный бульон (МПБ)] и растительные (например, настои сена и соломы, отвары злаков, дрожжей или фруктов, пивное сусло и др.).

Е стественные среды могут содержать компоненты животного (например, кровь, сыворот­ка, жёлчь) или растительного (например, кусочки овощей и фруктов) происхождения.

По назначению выделяют консервирующие среды (для первичного посева и транспортиров­ки), среды обогащения (для накопления определённой группы бактерий), среды для культиви­рования (универсальные простые, сложные специальные и для токсинообразования), среды для выделения и накопления (консервирующие, обогащения и элективные) и среды для идентифи­кации (дифференциальные и элективно-дифференциальные).

По загрязнённости материала. Если материал слабо загрязнён посторонней микрофлорой, то для выделения чистых культур применяют простые (по составу) среды. При обильной контами­нации сапрофитами используют специальные или элективные (для отдельных видов), селек­тивные (только для отдельных бактерий), дифференциально-диагностические (для облегчения идентификации) среды.

Характеристики сред

Консервирующие среды предупреждают отмирание патогенов и подавляют рост сапрофитов. Наибольшее применение нашли глицериновая смесь (среда Тига), гипертонический ра­створ, глицериновый консервант с LiCl₂, раствор цитрата натрия и дезоксихолата натрия (среда Бенгсанга-Эллиота).

Среды обогащения (например, среда Китта-Тароцци, селенитовый бульон, тиогликолятная среда) применяют для накопления определённой группы бактерий за счёт создания усло­вий, оптимальных для одних видов и неблагоприятных для других. Наиболее часто в качестве подобных агентов используют различные красители и химические вещества — соли жёлчных кислот, тетратионат Na⁺, теллурит К⁺, антибиотики, фуксин, генциановый фиолетовый, брилли­антовый зелёный и др.

Элективные и селективные среды (например, среды Уйлсона-Блэра, Эндо, Плбскирева, Мак-Конки) предназначены для первичного посева материала или для пересева с консервирующих сред или сред обогащения с целью получения чистой культуры. Среды готовят с учётом биохимических и энергетических потребностей микроорганизмов. Соответственно, выделяют кровяные и сывороточные среды (например, Лёффлера, Бордё-Жангу), яичные среды (например, Лёвенштайна-Йенсена) и др Дифференциально-диагностические среды (например, среды Хисса, Кларка) применяют для изучения и идентификации отдельных типов, видов и групп бактерий. В качестве основы применяют различные органические и неорганические соединения, гидролизаты казеина, пептонную воду, бульон Хоттингера-Мартена, дополненные углеводами, спиртами, мочевиной и другими веществами; при их расщеплении происходит сдвиг рН в кислую (углеводы, спирты, липилы) или щелочную (белки) сторону. Соответственно, выделяют среды с углеводами и спир­тами, среды с мочевиной, среды для определения индолообразования, среды для определения протеолитической активности и комбинированные (политропные) среды. В такие среды так­же часто вносят различные индикаторы (например, бромтимоловый синий, индикатор Андраде, бромкрезоловый пурпурный и крезоловый красный), помогающие визуально определить изме­нение рН, характерное для различных микроорганизмов. В частности, сдвиг в кислую сторону вызывает покраснение среды с реактивом Андраде или пожелтение при использовании среды с бромтимоловым синим, тогда как при защелачивании реактив Андраде и индикатор бром-тимоловый синий не меняют цвет среды. Все дифференциально-диагностические среды разде­ляют на четыре основные группы.

Среды, содержащие белки, дающие характерные изменения под действием бактериальных ферментов (кровь, желатина, молоко и др.), применяют для определения гемолитических или протеолитических свойств. Наиболее распространены мясопептонная желатина (МПЖ), свер­нувшаяся лошадиная сыворотка, молоко и кровяной агар (КА).

Среды, содержащие углеводы или многоатомные спирты. Ферментативное расщепле­ние субстратов приводит к сдвигу рН и изменению окраски среды, а иногда и образованию газа. Наиболее распространены цветные среды с различными углеводами (например, с бром-тимоловым синим, индикатором ВР), лакмусовое молоко (среда Минкевича) и среды Хисса. Из углеводов наиболее часто используют моносахариды (ксилозу, арабинозу, глюкозу, фруктозу, маннозу, галактозу), дисахариды (лактозу, мальтозу, сахарозу), полисахари­ды (крахмал, гликоген, инулин, декстрин), спирты (дульцит, маннит, сорбит, глицерин) и гликозиды (адонит, инозит, салицин, амигдалин).

Среды для определения редуцирующей способности. В эту группу входят среды с крас­ками, обесцвечивающимися при восстановлении (например, метиленовый голубой, нейтраль­ный красный, индигокармин), а также среды с нитратами для определения денитрифицирую­щей активности бактерий (при положительном результате среды окрашиваются в синий цвет).

Среды, включающие вещества, ассимилируемые только определённой группой бактерий. Наиболее известны цитратный агар Симмонса и цитратная среда Козера.

Посев и культивирование

При достаточном содержании патогенных бактерий в образце проводят посев на плотные пита­тельные среды (для получения изолированных колоний). Если в исследуемом материале бактерий мало, то посев проводят на жидкие среды обогащения. На практике выделение относительно неприхотливых бактерий обычно проводят на простых средах (например, на КА, агаре Плоскирева, тиогликолевом бульоне, агаре Сабуро и т.д.). Для выделения прихотливых видов в среды вносят питательные вещества (кровь, сыворотку, дрожжевой экстракт и др.), а также погло­тители токсических метаболитов, образующихся при росте бактерий (например, дре­весный уголь). Для посевов применяют микробиологические петли, реже иглы и шпатели.

Получение изолированных колоний

Для получения изолированных колоний на практике наиболее часто используют модифика­цию рассева по Дригальски. Для этого материал наносят на поверхность плотной питательной среды ближе к краю и делают «бляшку». Затем из неё материал распределяют по четырём квадратам, проводя петлёй штрихи, как показано на рис. 1-12, обжигая петлю после засева каждого квадрата. Подобный метод позволяет получить изолированные колонии и изучать их. Исключение составляет техника посева при бактериологическом исследовании мочи (техника штрихового засева показана на рис. 1-13). Указанные методы пригодны для посева аэробных и факультативно анаэробных бактерий, а также нестрогих анаэробов.

Температура культивирования

Патогенные бактерии вариабельны в отношении температур, оптимальных для их роста, но большинство из них неплохо развивается при 35-37 °С. Исключение составляют некоторые атипичные микобактерии, возбудитель чумы, листерии и лептоспиры (температурный оптимум 20-30 °С), а также Campylobacter jejuni (температурный оптимум 42 °С).

.

Состав газовой среды

Бактерии чётко разделяют по отношению к содержанию кислорода в атмосфере культиви­рования.

Аэробы. Посевы аэробных бактерий культивируют в простых термостатах. Некоторые факуль­тативно анаэробные виды также можно культивировать при атмосферном воздухе, но более оптимально помещение посевов в термостаты с дозированной подачей кислорода. На практи­ке их чаще помещают в эксикаторы, куда вносят горящую свечу; после её выгорания в атмо­сфере снижается содержание кислорода и повышается содержание СО₂.

Анаэробы. Посевы анаэробных бактерий в жидких средах заливают вазелиновым или другим маслом. При использовании плотных сред посевы культивируют в специальных устройствах — анаэростатах (откуда откачивают воздух) либо заливают посевы тонким слоем агара. Анаэ­робные условия можно создать химическим путём, поместив посевы в эксикаторы, на дно которых заливают щелочной раствор пирогаллола, поглощающего кислород. Также можно использовать методы Фортнера, Цейсслера и Вейнберга.

Метод Фортнера. Посевы проводят на чашку Петри с толстым слоем среды, разделённым пополам узкой канавкой, вырезанной в агаре. На одну половину засевают культуру аэроб­ных бактерий, на другую — анаэробных. Края чашки заливают парафином и инкубируют в термостате. Первоначально наблюдают рост аэробов, а затем (после поглощения кислоро­да) — рост анаэробов.

Метод Цейсслера используют для выделения чистых культур спорообразующих анаэробов. Для этого проводят посев на среду Китта-Тароцци, прогревают 15 мин при 80 °С (для унич­тожения вегетативных форм), заливают вазелиновым маслом и инкубируют 24 ч. Затем про­водят посев на сахарно-кровяной агар для получения чистых культур. После 24-часового культивирования подозрительные колонии изучают и отсевают на среду Китта-Тароцци (с последующим контролем чистоты выделенной культуры).

Метод Вейнберга используют для получения чистых культур строгих анаэробов. Культуры, выращенные на среде Китта-Тароцци, вносят в сахарный бульон. Затем пастеровской пи­петкой с запаянным концом материал переносят в узкие пробирки (трубки Виньяля) с сахарным МПА, погружая пастерку до дна пробирки. Засеянные пробирки быстро охлаждают холодной водой, что позволяет зафиксировать отдельные бактериальные клетки в толще затвердевшего агара. Пробирки инкубируют, и изучают выросшие колонии. При обнаружении подозрительной колонии на её месте делают распил, колонию быстро отбирают и засеивают на среду Китта-Тароцци (с последующим контролем чистоты выделенной культуры).

1

Методы культивирования

При выращивании бактерий применяют стационарный способ, способ глубинного культивирования с аэрацией и метод проточных питательных сред. В соответствии со способами выращивания бактериальные культуры разделяют на периодические (при стационарном и глубинном культивировании) и непрерывные (при проточном культивировании).

Характеристики

Список файлов реферата