Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 2)

В любом случае необходимо прежде всего получить фрагменты ДНК картируемого участка в больших количествах. ДНК размножают обычно двумя способами – клонированием и ПЦР.

КЛОНИРОВАНИЕ – по современным понятиям сравнительно примитивный метод. Последовательность действий такова: порезали рестриктазой изучаемый участок ДНК – вставили каждый ее отрезок в молекулу вектора (бактериальной, дрожжевой или другой кольцевой ДНК), разрезанную в одной точке той же рестриктазой: получилась рекомбинантная кольцевая ДНК с "чужой" вставкой. Такую смешанную ДНК "вселяют" в ядро клетки-хозяина (обычно бактерии), и та принимается делиться в культуре, благодаря рекомбинантная ДНК – и.о. ее генома – размножается практически до любого количества копий. Результат – набор клонов разных фрагментов картируемой ДНК, или, как его обычно называют, библиотека клонов.

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР) – лабораторный синтез фрагментов ДНК без клетки-хозяина. В пробирку к фрагменту, который надо размножить, "подсаживают":

а) фермент ДНК-полимеразу, который осуществляет воспроизведение ДНК в живых клетках;

б) стройматериал, т.е. отдельные нуклеотиды;

в) прамеры – короткие цепочки нуклеотидов, соответствующие концам размножаемого фрагмента. Тут, как видите, слабое место метода: про упомянутый участок надо кое-что знать заранее – а именно структуру праймеров…

Затем пробирку нагревают – фрагмент от жары "расклеивается", разделяясь на две цепи; пробирку охлаждают – праймеры присоединяются к концам фрагмента и полимераза начинает свое дело. Чередуя нагревания и охлаждения, можно за полтора часа довести количество копий нужного участка ДНК до нескольких миллионов – в чем и состоит главное преимущество ПЦР перед клонированием. Но у нее есть два недостатка. Один уже упомянут – нужно знать праймеры "в лицо", иначе реакцию не удастся запустить. Второй – техническая невозможность копировать фрагменты длиннее 5-6 п.н.

После того как все фрагменты ДНК получены в достаточном количестве копий, их упорядочивают, для чего сперва разделяют электрофорезом, а затем химически связывают (гибридизуют) с меченым зондом, чтобы каждый фрагмент встал на свое место и, так сказать, просигналил о себе: вот он я!

Крупномасштабные физические карты генома бывают двух типов. Первый – МАКРОРЕСТРИКЦИОННЫЕ (по принципу "сверху вниз"): ДНК режут редкощепящей рестриктазой на крупные куски, упорядочивают их, потом делят на более мелкие, которые тоже упорядочивают. Такая карта охватывает довольно большие участки генома – до 10 Мб – и не содержит пробелов. Но ее разрешение сравнительно невелико – от 1 Мб до 100 кб.

Гораздо выше точность у КАРТ КОНТИГ. Их строят по обратному принципу – "снизу вверх". Хромосому шинкуют на очень короткие фрагменты, размножают их и упорядочивают. Набор упорядоченных коротких фрагментов, покрывающих определенный участок хромосомы, - это и есть контига. А где сама она расположена на хромосоме, можно установить методом FISH.

Правда, карту контиг трудно расширить до крупных районов хромосомы, поскольку нельзя размножать большие фрагменты ДНК – ни клонированием, ни ПЦР. Хотя в последние годы достигнут серьезный успех: удалось создать гигантскую молекулу-вектор, в которую можно встроить участок человеческой ДНК размером до мегабазы. Этот вектор называется YAC – the yeast artificial chromosome, искусственная дрожжевая хромосома. До внедрения YAC в качестве векторов применялись в основном бактериальные плазмиды – крошечные колечки ДНК, несшие вставки чужеродного материала максимум в 20-40 кб. Смысл применения YAC – значительное уменьшение числа клонов, которые нужно упорядочивать.

Прогулка по хромосоме

Все описанные выше методы позволяют создавать либо приблизительные карты обширных регионов генома, либо подробные "топографические планы" мелких его участков. Как совместить то и другое – закартировать большой район, но детально?

Современная стратегия заполнения пробелов – прогулка по хромосоме. Ее начинают с какого-нибудь короткого участка, чья нуклеотидная последовательность уже расшифрована. По ней синтезируют праймер, гибридизируют его с первым попавшимся клоном из неупорядоченной геномной библиотеки, а затем "подключают к делу" полимеразу – она делает цепь, комплементарную данному клону. Затем эту цепь секвенируют, а ее хвостик используют в качестве праймера для следующего шага по хромосоме.

Вот и прозвучало слово "секвенирование". Так называется новейший, прославленный, подробнейший, точнейший… и, с позволения сказать, тягомотнейший метод картирования генома. Его сущность – полная расшифровка последовательности нуклеотидов. Чтобы в деталях объяснить, как она осуществляется, потребовалась бы двухчасовая лекция по молекулярной биологии. Посему в двух словах: из библиотеки клонов извлекают фрагмент ДНК, вновь клонируют, а получившиеся копии химически преобразуют в набор отрезков ДНК, различающихся по длине лишь на один нуклеотид (вот именно эту стадию практически невозможно описать общедоступным языком – настолько она сложна даже для генетика-профессионала). Затем упомянутые отрезки разделяются на гелевой пластинке в пульсирующем электромагнитном поле (пульс-форез). Последовательность нуклеотидов читают по фореграмме: каждый отрезок "уезжает" по гелевой пластинке настолько далеко, сколь велика его длина, и занимает место в одном из четырех столбцов – в зависимости от того, на какой нуклеотид (а их всего четыре типа) он длиннее соседнего.

Хотя современные усовершенствования позволяют изучать одновременно до 40 клонов на одном геле, затраты времени и средств все равно огромны. Даже опытная рабочая группа на лучшем оборудовании секвенирует в год не более 100000 п.н. в год. Если принять стоимость анализа каждой пары оснований за доллар – весь геном человека может быть секвенирован за 3000 лет, и обойдется его изучение в 3 миллиарда долларов. Сумма по нынешним временам вполне приемлемая хотя бы на слух, но вот время… Сейчас, правда, развиваются технологии секвенирования второго поколения – высоковольтный капиллярный электрофорез, ионизационная резонансная спектроскопия. Они ускоряют процесс на порядок – стало быть, хватит трех веков (за те же деньги). Обнадеживает, но не слишком.

По всей видимости, программа "Геном человека" будет успешно выполнена лишь по технологиям третьего поколения, ныне существующих в зачаточном состоянии. К ним в частности, относится прямое чтение последовательности нуклеотидов с помощью сканирующей туннельной или атомной микроскопии. Сегодняшняя наука делает ставку именно на такие методы – иначе прогулка по человеческим хромосомам грозит затянуться на тысячелетия.

Заключение

И вот на глаза мне попалась журнальная заметка, датированная мартом 2000 года, о том, что расшифрована последовательность ДНК 22-й человеческой хромосомы. Это первая наиболее полная расшифровка целой структуры в генетическом аппарате человека и – 1/23 часть глобального проекта "Геном человека". Впечатляют масштабы коллективного авторства – 216 ученых из Великобритании, США, Японии, Канады и Швеции. Только эта хромосома содержит более 20 генов, изменения в которых приводят к известным заболеваниям человека, в частности (предположительно), и один из генов, обусловливающих шизофрению. Для полного раскрытия генома человека трудиться еще придется долго. Однако, по мнению руководителя геномного проекта Фрэнсиса Коллинза, нынешнее достижение можно уже сравнить с "расщеплением атома или полетом на Луну".

Жуль Верн в своем романе "20 тысяч лье под водой" предполагал создание машины, позволяющей человеку изучать морские глубины. Теперь батискафами, изобретенными Жаком Ивом Кусто, пользуется весь мир, совершенствуя знания о морской флоре и фауне. В 1990 году Гарри Гарриссон в романе "Спасательная шлюпка" описал создание сильных, здоровых, но генетически подавленных рабов. А теперь…

Может человечеству стоит задуматься над другими последствиями расшифровки генома человека, кроме искоренения наследственных заболеваний. Ведь не ровен час, когда они, эти последствия сами "свалятся нам на голову".

Вспоминая нацистские чистки, начитавшегося Ницше, Гитлера, испытания Водородной бомбы, попытки Генриха Гиммлера создать сверхчеловека, возникает вполне резонный вопрос: А ЧТО ДАЛЬШЕ?

Список литературы

1. Журнал "Техника Молодежи". Разные материалы за 1999-2000 г.;

2. Материалы, опубликованные в сети Интернет на сайтах www.kulichki.ru, www.lenta.ru, www.nature.com.

Характеристики

Список файлов реферата