94251 (613095), страница 2

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 2)

Чувствительность и рабочий диапазон концентраций определяемого вещества. Типичная калибровочная кривая и профиль точности для измерения LH представлены на рис.3. Статистическая обработка данных была выполнена с помощью программы MR С Immunoassay.

Точность. Точность определения FSH в одном анализе оценивали путем анализа 10 повторов проб из трех пулов плазмы со средним содержанием гормона: 9,7; 39,8; и 72,0 м. ед/л. Точность определения FSH в различных анализах оценивали путем анализа повторов проб. из четырех пулов плазмы в шести различных анализах. Результаты оценок точности представлены в табл.2.

Разброс результатов. Концентрацию LH в 77 пробах плазмы, отобранных в клинике King's College от пациенток, страдающих бесплодием, определяли методом DELFIA и обычным РИА. Профиль разброса результатов представлен на рис.4. Для более чувствительного метода DELFIA типичны отклонения в отрицательную сторону по сравнению со значениями, полученными методом РИА.

Определение гормонов методом конкурентного иммуноанализа. Сообщалось о применении конкурентного метода DELFIA для определения кортизола и дигоксина. В этом методе определяемое вещество и определенное количество конъюгата гаптен-белок, иммобилизованного на твердой фазе, конкурируют за ограниченное число центров связывания антител, меченных Ей.

На этом же принципе основаны разработанные нами методики анализа DELFIA для прямого определения прогестерона и эстрадиола в плазме периферической венозной крови и эстрон-3-глюкуронида в разбавленных пробах мочи. В качестве иллюстрации на рис.5 представлена схема методики определения концентрации прогестерона.

Чувствительность, точность и рабочий диапазон концентраций определяемого вещества. Типичная калибровочная кривая и профиль воспроизводимости определения прогестерона представлены на Рис.6.

Разброс результатов. Концентрацию прогестерона в пробах плазмы определяли методом DELFIA и обычным методом РИА. Результаты представлены на рис.7. Наблюдающиеся при низких концентрациях отклонения в отрицательную сторону обусловлены завышенными результатами метода РИА; впоследствии они были откорректированы.

Результаты определения прогестерона, полученные методом DELFIA, хорошо согласуются с данными, полученными с применением выпускаемых промышленностью наборов РИА для прямого определения, например Coat-a-Count и New Amerlex-M.

2.1 Альтернативные методы определения гаптенов

Меченый антиген. Ловгреи описал конкурентный метод определения прогестерона в периферической плазме с помощью нового конъюгата прогестерон-EDTA-Eu. В этом методе используется строго ограниченное количество иммобилизованных на твердой фазе антител, полученных к конъюгату 11а-сукцинил-про-гестерона с БСА.

Меченые антитела. Предложено несколько подходов к разработке иммунометрических методов определения гаптенов.

На рис.8 представлена схема одного из них, включающего несколько стадий неравновесных односайтовых анализов. В соответствующей методике применены моноклональные антитела, меченные аминофенил-EDTA-Eu, и избыток конъюгата 11-сукцинил-прогестерона с тироглобулином быка, иммобилизованного на поверхности пластиковых вкладышей. Вкладыши помещают в лунки стрипов микротитровальных планшетов. Метку измеряют в "свободной" фракции антигена на вкладыше после промывки и удаления остатков биологических образцов. В предварительных экспериментах достигнуты большая чувствительность и лучшая точность, чем в конкурентных методах иммуноанализа.

3. Перспективы развития флуоресцентного иммуноанализа с временным разрешением

Разработка новых методов иммуноанализа. Разработка новых исследовательских методов иммуноанализа затруднена из-за недоступности соответствующего реагента для введения метки. Такие реагенты очень стабильны, а методы получения конъюгатов с использованием этих реагентов очень просты. Выпуск таких реагентов в промышленном масштабе значительно ускорит внедрение методов;: флуоресцентного иммуноанализа с временным разрешением и разработку новых исследовательских методов иммуноанализа.

3.1 Скрининг

Клинические анализы. Аренде и Норгаард-Педерсен изучали возможность применения метода DELFIA для скрининга конгенитального пшотироидизма путем измерения уровня TSH в пятнах крови на фильтровальной бумаге с точки зрения возможности применения в клинической практике н в сравнении с методом РИА. Анализ 19 проб крови новорожденных с конгенитальным гипотироидизмом дал положительные результаты как в DELEIA, так и в РИА. Анализ 3944 проб двумя методами позволил обнаружить конгенитальный гипотироидизм в одной пробе. Как показали повторные анализы, метод DELFIA реже дает ложные положительные результаты и характеризуется лучшей воспроизводимостью как в одном анализе, так и между анализами.

Моноклональные антитела. Доступность антимышиных IgG, меченных европием, позволила разработать простые методики скрининга клонов, продуцирующих антитела. Метод DELFIA дополняет существующие иммуноферментные методы скрининга моноклональных антител.

Внелабораторные анализы. Ощущается необходимость разработки и создания специальных приборов для каждой сферы применения флуоресценции с временным разрешением. Должны выпускаться автоматические флуориметры двух типов. Приборы первого типа должны быть простыми, надежными, способными работать на сухих элементах питания. В будущем приборы этого типа, как и соответствующие реагенты, должны использоваться и в больницах, и на дому. Такой прибор позволит осуществить довольно сложные клинические анализы, например, непосредственно в операционной или на дому, где он даст возможность самим больным контролировать ход лечения. Приборы второго типа должны обеспечивать оценку профилей определяемых веществ на соответствующих стрипах микропланшетов или дисках.

Безразделительные анализы. Куо и др. описали применение конъюгата производного хелата тербия с Антигеном, полученного с помощью бифункционального хелатирующего агента 1 - EDTА. Интенсивность флуоресценции измеряли непосредственно в супернатантной жидкости, содержащей биологический материал, без добавления усиливающего реагента. Недостатком этой методики является ее невысокая чувствительность. Этот недостаток можно преодолеть за счет более эффективных меток. Флуоресцентные метки такого типа могут содействовать созданию безразделительных методов, основанных на принципе усиления или гашения флуоресценции антителами.

Одновременные анализы. На рис.9 представлены спектры эмиссии европия и тербия. Максимумы эмиссии этих лантанидов расположены при различных длинах волн, что создает возможность их одновременного определения с помощью соответствующих фильтров.

Бадор и др. сообщили об использование вропия и самария в флуоресцентном иммунометрическом анализе с временным разрешением для определения FSH. Можно надеяться, что вскоре будут созданы методы одновременного определения нескольких веществ с помощью антител, меченных хелатами различных лантанидов.

Пути повышения чувствительности анализов. Джексон и Экинс теоретически показали, что максимальную чувствительность обеспечивают неконкурентные методы иммуноанализа и что наиболее перспективно в настоящее время для этих целей применение флуоресценции с временным разрешением. Для этого в свою очередь необходимы метки с максимальной удельной активностью и методы иммуноанализа, обеспечивающие минимальную фоновую флуоресценцию.

4. Пути совершенствования флуоресцентного анализа delfia

Флуориметрия с временным разрешением. Основной недостаток флуоресцентного иммуноанализа связан с необходимостью диссоциации иммунного комплекса перед измерением концентрации европия. Эта операция в целом снижает точность анализа. Кроме того, добавление усиливающего раствора повышает фоновый сигнал. Оба этих недостатка можно преодолеть за счет новых высокофлуоресцирующих хелатов и измерения интенсивности флуоресценции твердой фазы. Применение лазеров и твердотельных фотоумножителей также будет способствовать разработке более чувствительных методов анализа.

Применение других типов фотолюминесценции. Фосфоресцентный иммуноанализ, как и флуоресцентный иммуноанализ с временным разрешением, позволяет устранить помехи компонентов пробы и снизить фоновый сигнал. Сидки и Ландон описали несколько методик иммуноанализа с использованием эритрозина в качестве фосфоресцентной метки. Эмиссия эритрозина затухает в течение нескольких микросекунд и характеризуется большим стоксовым сдвигом. Для получения меченых конъюгатов можно применять эритрозинизотиоцианат и те же химические приемы, что и в случае флуоресцеинизотиоцианата.

Выводы

Радиоактивные маркеры сыграли большую роль в разработке различных методов иммуноанализа для определения самых разнообразных соединений. Однако можно ожидать, что наметившаяся тенденция разработки люминесцентных методов иммуноанализа без радиоактивных меток будет развиваться и в будущем. Действительно, чувствительность определения ионов европия очень высока, а удельная активность меченных европием конъюгатов может превышать активность конъюгатов, меченных радиоизотопами. Следовательно, метод DELFIA может обладать большей чувствительностью, чем метод ИРМА. Применяемые в DELFIA реагенты сравнительно безопасны и легко поддаются захоронению. Меченые вещества очень устойчивы и не теряют активности в течение по меньшей мере 1 года. Метод DELFIA успешно применен для разработки двухсайтовых иммунометричёских анализов белков и прямых конкурентных анализов гаптенов.

Можно надеяться, что введение новых флуоресцентных меток и соответствующих приборов будет способствовать разработке методик, которые можно будет выполнять в палатах больниц, поликлиниках и иа дому. Биохимические и физиологические исследования требуют еще большего повышения чувствительности, и здесь может оказаться очень существенным развитие люминесцентного иммуноанализа.

Характеристики

Список файлов курсовой работы