91896 (612900), страница 4

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 4)

Ризогенная культура гармалы хорошо росла в жидкой питательной среде при условии её небольшого объёма и постоянного перемешивания. Полное погружение корней в питательную среду и статика не обеспечивали достаточной для роста аэрации культуры. Наилучший рост ризогенной культуры наблюдался на подложках (вискоза и бумажный фильтр), смоченных избытком питательной среды. При таком способе выращивания трёхнедельная культура гармалы достигала 20-кратного увеличения массы.

Генетически трансформированная ризогенная культура гармалы наряду с проявлением корневой дифференциации восстанавливала и способность к биогенезу индольных алкалоидов. Просмотр культур в УФ-свете показывал интенсивную флуоресценцию корней, типичную для гармина и гармалола. Хроматоспектрометрический анализ метанольных экстрактов из ризогенной культуры показал, что она по количественному и качественному составу алкалоидов мало отличается от корней ювенильных растений гармалы. Если при максимальном содержании -карболиновых алкалоидов в неорганизованно растущих тканях концентрация гармина в них была более чем в 100 раз, а гармалола – в 5 раз ниже концентрации этих алкалоидов в корнях проростка, то в трёхнедельной ризогенной культуре 12-го пассажа концентрация гармина составляла 1/3 от концентрации алкалоида в корнях проростка, а концентрация гармалола превышала концентрацию алкалоида в корнях. При этом восстанавливалось и типичное для корней целого растения преобладание гармина над гармалолом.

Если принять во внимание интенсивность роста ризогенной культуры (20-кратное увеличение массы) и непрерывность её выращивания, то можно увидеть, что продуктивность такой культуры значительно превышает продуктивность ювенильных растений гармалы.

Таким образом, генетически трансформированная культура гармалы, наделённая способностью к синтезу гормонов, обеспечивающих появление корневой дифференциации, характеризуется высоким уровнем содержания -карболиновых алкалоидов, который вполне сравним с уровнем биосинтеза этих алкалоидов в органах целого растения. Чётко установленная зависимость между корневой дифференциацией и уровнем синтеза -карболиновых алкалоидов подтверждает правильность гипотезы о локализации образования этих индольных алкалоидов в корнях гармалы. В этом отношении ризогенная культура гармалы наряду с аналогичными культурами белладонны, дурмана, белены и других паслёновых служит примером корнеспецифичности биосинтеза определённых групп алкалоидов.

Результаты, полученные с трансформированной культурой гармалы, показывают возможность и эффективность использования приёмов генетической инженерии не только на растениях семейства паслёновых, но и на растениях других семейств, в которых образование алкалоидов или других вторичных веществ локализовано в корневой системе. Индукция биосинтеза вторичных веществ в таких генетически изменённых культурах может служить реальной основой для получения искусственно выращиваемых растительных систем, продуцирующих те же ценные биологические вещества и на том же количественном уровне, что и целое растение.

3.3 Накопление алкалоидов в культуре ткани раувольфии змеиной

Культура ткани раувольфии змеиной (Rauwolfia serpentina) является перспективным источником аймалина – алкалоида группы индолина, обладающего противоаритмическим действием. Аймалин содержится в смеси алкалоидов биомассы в количестве 30-40%. 40-50% составляет вомиленин – индолениновый алкалоид, который рассматривается как биогенетический предшественник аймалина. Превращение вомиленина в аймалин под действием ферментов, выделенных из клеток раувольфии, в настоящее время осуществлено in vitro и включает в себя гидрирование вомиленина и его метилирование. Источником пиридиннуклеотидов является витамин РР (никотиновая кислота и никотинамид). Перенос метильных групп осуществляется с помощью серосодержащих аминокислот – метионина и ацетилметионина.

Целью настоящей работы было выяснение влияния витамина РР, серосодержащих аминокислот, вомиленина (как предшественника аймалина) и сульфат-иона на накопление алкалоидов, в частности, аймалина в стеблевой культуре ткани раувольфии (клеточная линия А). В качестве контроля использовали регламентную питательную среду (Р). В опытных вариантах в неё вносили 2 или 5 мг/л никотиновой кислоты (среды Н2 и Н5), 10 мг/л метионина или ацетилметионина (среды М и АМ), 1 мг/л вомиленина (среда В). Вомиленин добавляли после автоклавирования среды в асептических условиях, остальные добавки вносили до автоклавирования. Среды S1 и S2 были обеднены неорганической серой: в S1 не вносили сульфат аммония; в S2, кроме того, в 5 раз уменьшили содержание сульфата магния. Опыты проводили на трёх пассажах в десятикратной повторности. После культивирования в течение 70-75 суток при 2620 биомассу высушивали. В ней титриметрически определяли сумму алкалоидов, фотоколориметрическим методом – аймалин, хроматоспектрофотометрическом – вомиленин.

Результаты опытов приведены в таблице. Они показывают, что добавление к среде никотиновой кислоты не влияло на содержание алкалоидов в биомассе. Снижение содержания в среде сульфат-иона привело к уменьшению количества суммы алкалоидов, аймалина – в 1,5 раза, и к возрастанию (приблизительно в 2 раза) содержания в биомассе вомиленина. При введении в среду серосодержащих аминокислот в 1,2 раза увеличилось общее содержание алкалоидов в биомассе, а содержание аймалина возросло в 2 раза. Добавление вомиленина вызвало накопление в биомассе аймалина при сохранении контрольного уровня содержания суммы алкалоидов. Это вполне согласуется с литературными данными о превращении вомиленина в аймалин.

Результаты исследования свидетельствуют о том, что накопление алкалоидов в биомассе связано с содержанием в среде как неорганической серы, так и серосодержащих аминокислот. Для получения обогащенной аймалином биомассы целесообразно добавлять к питательной среде метионин и ацетилметионин.

3.4 Алкалоиды каллусных тканей мака прицветникового

Мак прицветниковый (Papaver bracteatum) может быть использован c целью получения тебаина – морфинового алкалоида, являющегося предшественником кодеина и морфина. Тебаин составляет до 98% от суммы алкалоидов P.bracteatum и в лабораторных условиях легко может быть переведён в кодеин наиболее широко распространённое в мире противокашлевое средство.

Литературные данные свидетельствуют о том, что в культуре клеток растений рода Papaver доминируют алкалоиды протопионового, бензафенантридинового и тетрагидропротоберберинового типов, берущих начало от (+)-ретикулина и отсутствуют, либо присутствуют в следовых количествах алкалоиды морфинановой группы, характерные для растений это рода. При повышении уровня дифференцировки может проявляться тенденция к восстановлению спектра алкалоидов, характерного для целого растения.

Целью настоящей работы являлось получение каллусных тканей P.bracteatum, регенерантов из них и сравнение спектров алкалоидов в культуре тканей и в онтогенезе целых растений.

Штамм Р11 был способен к регенерации при культивировании по следующей схеме: каллусная ткань, выращиваемая в темноте, пересаживалась на среду, отличающуюся от исходной отсутствием гормонов, и выдерживалась в течение 30 дней в темноте. При этом в примыкающем к среде слое каллуса образовывались очаги дифференциации, которые затем пересаживали на свежую питательную среду того же состава и выставляли на свет. Через 2-3 недели внутри и на поверхности каллуса наблюдалось появление зачатков зелёных листочков, иногда образовывались корни. По мере формирования листочков регенеранты высаживали на среду Стрита для активации образования корней. При достижении корнями длины 5-10 мм регенеранты высаживали в вазоны со стерильной почвой и переносили в теплицу.

Присутствие в растительных образцах сангвинарина или тебаина определялось с помощью хроматографии хлороформного экстракта лиофилизированной ткани в тонком слое силикагеля, содержащего и не содержащего люминесцентную добавку, для раздельного определение флуоресцирующих и поглощающих зон.

Количественное определение сангвинарина в культуре тканей рассчитывали по экстинкции при 340 нм вытяжки 10%-ной H2SO4 из хлороформного экстракта лиофилизированной ткани. О количестве алкалоида, переходящего в сангвинарин, судили по разности в содержании сангвинарина в подкисленном муравьиной кислотой хлороформном экстракте до и после облучения его светом лампы ДРШ-250 в течение 1 минуты.

От различных частей двулетних растений мака прицветникового кавказской популяции и популяции Arya 11 были получены каллусные ткани. При качественном изучении спектра алкалоидов в каллусных культурах тебаин обнаружен не был, в то время как в тканях всех штаммов присутствовал сангвинарин, не характерный для целого растения. Содержание сангвинарина в тканях колебалось от 0,5 до 1,7%, а в штамме, полученном из цветоноса растения популяции Arya 11, оно составляло 2,70,4%. Наряду с сангвинарином в тканях был обнаружен алкалоид, который на свету переходил в сангвинарин. Содержание его в каллусных тканях по отношению к общему содержанию сангвинарина составляло от 11 до 40%.

Изучение спектров целых растений показало, что они способны к синтезу не только тебаина, но и сангвинарина. Тебаин присутствовал во всех частях растений на протяжении всего времени наблюдения за ними, в то время как сангвинарин был обнаружен в листьях растений только первого года жизни, при чём содержание его с возрастом снижалось. В растениях, выращенных в естественных условиях, в пределах своего ареала, сангвинарин обнаружен не был, и биосинтез его является, по-видимому, явлением, не характерным для сформировавшихся растений.

Из этого факта, что растения мака прицветникового способны в определённых условиях продуцировать сангвинарин, следует, что проявление способности к его биосинтезу в культуре тканей данного растения не является случайным. Исследование спектра алкалоидов регенерантов, полученных из каллусной культуры штамма Р11, показало, что они были способны к биосинтезу сангвинарина, а тебаин был обнаружен в листьях растений-регенерантов лишь спустя 5 месяцев после выращивания их теплице.

Таким образом, способность к биосинтезу алкалоидов тебаина и сангвинарина позволяет выделить две противоположные ситуации: культура тканей способна к биосинтезу только сангвинарина, а выращиваемые в природных условиях растения – к биосинтезу одного тебаина. Кроме того, имеются и промежуточные переходные положения, когда биосинтез обоих алкалоидов одновременно идёт в растениях-регенерантах и в ювенильных растениях.

Характеристики

Список файлов курсовой работы