91896 (612900), страница 3

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 3)

Фенольные соединения (ФС), или полифенолы, занимают одно из центральных мест среди вторичных соединений благодаря их всеобщему распространению в растениях и разнообразным функциям (защита при патогенезах, механических повреждениях и облучении, использование в качестве запасного энергетического материала и др.). Полифенолы имеют также важное биотехнологическое значение (использование в медицине, пищевой промышленности и некоторых других областях народного хозяйства).

В качестве объекта, позволяющего исследовать процессы регуляции образования ФС, была использована культура тканей чайного растения. Известно, что это растение обладает специализированным обменом веществ, направленным на синтез соединений дифенилпропановой структуры (катехина, галлокатехина, катехингаллата.ю галлокатехингаллата).

Каллусные культуры стебля чайного растения (Camellia sinensis L., грузинская разновидность) выращивали в темноте или при непрерывном освещении (3000 лк) при 260 и относительной влажности воздуха 70% на оптимальной питательной среде, содержащей 2,4-Д (2*10-5 М) и глюкозу (2,5%). Содержание суммы растворимых ФС, флаванов и лигнина определяли спектрофотометрическими методами с использованием реактива Фолина –Дениса, ванилинового реактива и 2,6-дихлорхинонхлоримида соответственно.

Гетеротрофная (выращиваемая в темноте ) каллусная культура чайного растения, как и большинство пролиферирующих клеток, обладает более низким биосинтетическим потенциалом, чем исходная ткань интактного растения.

ФС – фенольные соединения; ФЛ – флаваны; ПА – проантоцианидины; ГК – галлокатехины и галловые эфиры катехинов; ФВ – флавонолы; Л – лигнин.

Как видно из представленных данных, в каллусной культуре, происходит как уменьшение общего содержания ФС, так и обеднение их качественного спектра. Однако, способность к синтезу характерных для чайного растения флаванов (представленных простейшими катехинами и их биогенетическими аналогами проанотоцианидинами), а также фенольного полимера лигнина сохраняется. При этом содержание проантоцианидинов и лигнина оказывается даже выше, чем в исходной ткани. Как свидетельствуют данные электронно-микроскопических исследований, это обусловлено, по-видимому, активацией эндомембранной системы клеток (эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи), являющиеся местом синтеза фенилпропаноидных предшественников. Из всего этого следует, что по составу фенольного комплекса и активности фенольного метаболизма гетеротрофная каллусная культура приближается к тканям корня интактного растения.

К числу факторов, способных оказывать влияние на биосинтетический потенциал клетки, относятся гормоны и гормоноподобные соединения, а также свет.

В гетеротрофной каллусной культуре чайного растения НУК (2*10-5 М), введённая в питательную среду взамен 2,4-Д, значительно стимулирует образование растворимых ФС (примерно в 10 раз) и в меньшей степени лигнина (в 3 раза). Это согласуется с литературными данными о том, что НУК может быть использована в качестве ауксина для «продукционных» сред, т. е. сред, способствующих накоплению вторичных соединений.

В отличии от НУК, 1 мг/л кинетина (5*10-6 М) способствует главным образом лигнификации тканей ( в 3 раза по сравнению с контролем), лишь незначительно влияя на образование флаванов.

Таким образом, введением в питательную среду гормоноподобных соединений можно добиться направленной регуляции синтеза определённых типов ФС в культивируемых in vitro клетках и тканях. При этом ауксины (НУК в большей степени, чем 2,4-Д) способствуют синтезу растворимых ФС, в том числе и характерных для чайного растения флаванов, тогда как цитокинины преимущественно воздействуют на образование лигнина. При этом во всех случаях происходит лишь количественные изменения в синтезе ФС, что обусловлено, по-видимому, активацией ферментов лишь тех звеньев фенольного метаболизма, которые являются общими для изученных полифенолов.

Влияние света. Так, перенесение гетеротрофных каллусных культур чайного растения в условия непрерывного освещения во время первых двух субкультивирований приводит главным образом к увеличению образования лигнина ( в 1,5 раза), тогда как образование растворимых ФС несколько снижается.

Влияние длительного освещения на образование суммы растворимых ФС(1), флаванов(2) и лигнина(3) в каллусной культуре чайного растения (в мг/г сухой массы). К – контроль; а – темнота; б, в – свет.

При длительном же пассировании культур в условиях непрерывного освещения (7 культуральных циклов) содержание суммы растворимых ФС, а также флаванов значительно увеличивается. Как показали электронно-микроскопические исследования, это связано с формированием в ткани хлоропластов. Следует также отметить, что такие фотомиксотрофные каллусные культуры помимо флаванов синтезируют ещё один класс характерных для чайного растения ФС, а именно флавонолы. Последние представлены кемпферолом и кверцетином, а также несколькими их гликозидами. Таким образом, формирование в каллусной культуре хлоропластов, являющихся одним из центров синтеза ФС в клетках растений, оказывает значительное влияние на их биосинтетический потенциал и, главное, способствует расширению спектра синтезируемых ФС.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что в случае гетеротрофных (не содержащих хлоропласты) каллусных культур усиление образования ФС при действии фитогормонов (ауксинов и цитокининов) или света ( на протяжении первых субкультивирований) происходит лишь за счёт активации ряда ферментов фенольного метаболизма (фенилаланинаммиаклиазы, 4-гидроксилазы коричной кислоты, оксициннамоил-КоА-лигазы и др.). В случае же частично фототрофных (содержащих хлоропласты) культур увеличение образования ФС происходит за счёт двух слагаемых: активации внехлоропластовых ферментных систем (как в первом случае) и благодаря функционированию в хлоропластах специализированного центра биосинтеза ФС.

3.2 Образование -карболиновых алкалоидов в культуре ткани гармалы обыкновенной

Гармала обыкновенная (Peganum harmala) – лекарственное растение, относящееся к семейству парнолистниковых (Zygophyllaceae) и широко применяемое в народной и официальной медицине. Терапевтический эффект экстрактов гармалы, обладающих значительным влиянием на сердечно-сосудистую деятельность и на центральную нервную систему, обусловлен содержанием в ней алкалоидов, которые оказывают ингибирующее действие на такие ферменты, как моноаминооксидаза и ацетилхолинэстераза. Помимо этого, алкалоиды гармалы проявляют антибактериальную активность, которая увеличивается при использовании УФ-света, что свидетельствует об их фототоксичности.

В целом растении обнаружены два типа алкалоидов – хиназолиновые, производные антраниловой кислоты, и индольные -карболинового типа, производные триптофана. При этом надземная часть растения содержит оба типа алкалоидов, в то время как -карболиновые алкалоиды характерны в основном для корней растения. Наиболее богаты алкалоидами семена гармалы, в которых содержание этих соединений может достигать 5 – 6 %. Корни растения в ранний период вегетации содержат около 1% алкалоидов, в то время как надземная часть – лишь 0,03%. Характер распределения алкалоидов и изменение их содержания в целом растении в течение его вегетации послужили основанием для высказывания предположения о том, что место синтеза -карболиновых алкалоидов являются корни гармалы.

Для экспериментальной проверки правильности этой гипотезы были введены в культуру каллусные ткани от гипокотиля и корня проростка гармалы, полученного из семян египетского происхождения. Ткани выращивали на агаризованной среде Мурасиге и Скуга с добавлением 2,4-Д (1 мг/л) и кинетина (1 мг/л). несмотря на то, что каллусные ткани были получены от частей ювенильного растения, они имели некоторые морфологические различия, которые сохранялись в течение четырёхлетнего культивирования: гипокотильная ткань была более плотной и отличалась от корневой ткани своей кремовой окраской, причём в ряде случаев на отдельных участках ткани была заметна яркая красная пигментация. Общим свойством тканей была их относительная гомогенность и отсутствие визуальных признаков дифференциации.

В каллусных тканях гармалы первых пассажей было обнаружено присутствие веществ, имеющих голубую и ярко-жёлтую флуоресценции. При экстрагировании лиофилизированных тканей метанолом и последующем хроматографировании концентрированных экстрактов в тонком слое силикагеля в системе хлороформ : метанол : аммиак (10 : 4 : 1) было показано присутствие в тканях четырёх -карболиновых алкалоидов – гармина, гармалина, гармола и гармалола, типичных для корней целого растения. Идентификация алкалоидов в каллусных тканях проводилась путём хроматографирования экстрактов с аутентичными образцами алкалоидов в различных системах растворителей и сопоставления спектров поглощения и спектров флуоресценции обнаруженных веществ с соответствующими спектрами чистых алкалоидов.

По своему качественному составу гипокотильная и корневая ткани не различались. Доминирующими алкалоидами в обеих тканях были гармин и гармалол, количественное содержание которых определяли по поглощению в УФ-свете (гармин – при 245 нм, гармалол – при 390 нм).

В условиях оптимального, но недифференцированного роста содержание гармина в каллусных тканях было почти в 500 раз, а гармалола – 20 раз ниже, чем в исходном растении. Концентрация гармина и гармалола была выше в гипокотильной ткани, однако с пассированием эта разница практически нивелировалась, а общее содержание алкалоидов резко снижалось.

С целью регуляции степени дифференциации каллусных тканей гармалы и соответственно образования в них алкалоидов в питательную среду вместо 2,4-Д вводили индолилмасляную кислоту (ИМК) (2 мг/л), а также в ряде случаев произвели замену кинетина на бензиламинопурин (1 мг/л). изменение гормонального состава питательной среды вызывает снижение ростовой активности тканей, увеличение их плотности и проявление в них признаков корневой дифференциации. Длительное субкультивирование тканей на среде, содержащей ИМК, приводило к появлению некрозов у корневой ткани и к прекращению её роста. Гипокотильная ткань сохраняла ростовую активность, однако она была значительно ниже, чем у ткани, растущей на 2,4-Д.

Химический состав каллусных тканей гармалы при перенесении их на среду, содержащую ИМК, показал, что концентрация -карболиновых алкалоидов в них резко увеличилась. Однако, снижение ростовой активности тканей при проявлении корневой дифференциации не компенсировалась увеличением концентрации алкалоидов, и общая продуктивность тканей при этом практически не увеличилась.

Ненадёжность изменения состава экзогенных гормонов и нестабильность роста каллусных тканей гармалы при таком способе регуляции их дифференциации и биосинтеза индольных алкалоидов заставили обратиться к генетической трансформации клеток гармалы с помощью Ri-плазмиды Agrobacterium rhizogenes. Для этого использовали дикий штамм А-4, суспензией клеток которого было проведено инфицирование пораненных участков гипокотиля стерильного проростка гармалы.

Через 3 – 4 недели после заражения на месте поранения и инфицирования можно было увидеть образование хорошо растущих адвентивных корней. При вычленении этого участка гипокотиля и его переносе на питательную среду, содержащую антибиотики (клафоран, 500 мг/л), после двух субкультивирований удавалось добиться элиминирования бактерий. Последующее отделение корней и перенесение их на безгормональную питательную среду привело к получению интенсивно растущей ризогенной культуры, которую принято называть культурой «бородатых корней» (“hairy root culture”). О том, что это генетически изменённая культура, свидетельствовал характер образования и роста корней, независимость их роста от экзогенных гормонов и содержание в культуре маннопина.

Характеристики

Список файлов курсовой работы