11893 (600640), страница 3

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 3)

Лигниназы сохраняют свою пероксидазную активность на прежнем уровне или даже повышают ее.

Активные формы кислорода крайне опасны для самого растительного организма, поэтому в растении существуют надёжные механизмы регуляции окислительной вспышки. Протекание окислительной вспышки допускается только во внеклеточном пространстве, а внутри клеток этот процесс подавляется компонентами антиоксидантной системы [1].

Альвазер и другие обнаружил, что H₂O₂ накапливается в маленьких группах клеток в неинокулированных листьях Arabidopsis после инфицирования его авирулентным штаммом P. syringae. Эти микровспышки наблюдаются на протяжении двух часов после начальной окислительной вспышки в инокулированных тканях, затем наблюдается формирование микроскопических HR повреждений. Используя каталазу чтобы удалить H₂O₂ или DPI чтобы ингибировать NADPH оксидазу, было показано, что обе окислительные вспышки необходимы для индуцирования SAR. Авторы предполагают, что микровспышки ROS могут акивировать защингые реакции на низком уровне во всем растении [6].

Липидные сигнальные молекулы

Новые работы подтверждают, что липидные молекулы могут быть мобильными сигналами для SAR. Мальдонадо показал, что мутанты dir1 (defective in induced resistance 1) развивают нормальную местную устойчивость к патогену, но не способны развивать SAR или экспрессировать PR белки в системных листьях. Таким образом, дикий тип dir1, который имеет сходство с липидным транспортом белков (LTPs), может участвовать в генерации или передаче мобильного сигнала.

Внеклеточное расположение LTPs подразумевает наличие мембранных рецепторов (PM), участвующих в передаче сигнала [6].

Регуляторный белок NPR1

Ключевой регулятор в развитии SAR является NPR1-белок. В норме NPR1 экспрессируеся в растении в малом количестве, но после проникновения патогена и обработки SA его уровень повышаетя в два – три раза. Он имеет две белок-белковые зоны взаимодействия, анкириновые повторности и BTB/POZ (Broad-Complex, Tramtrack, Bric-a-brac/Poxvirus, Zinc finger), а также предполагаемый сигнал ядерной локализации и области фосфорилирования [6].

Когда уровни SA низкие, NPR1 находится в своей олигомерной форме в цитоплазме, а в ответ на действие SA, регуляторный белок диссоциирует на мономеры, перемещается в ядро, и взаимодействует с факторами транскрипции TGA, тем самым, индуцируя экспрессию PR генов [6].

Для активации экспрессии гена PR-1 необходимы факторы TGA 2, 5 и 6. Для полной экспрессии данного гена необходим также фактор транскрипции WRKY70 [5].

Ядерная локализация NPR1 и активация TGA факторов возможно регулируются изменением окислительно-восстановительного потенциала клетки после обработки SA.

Когда белки были исследованы без восстановителя DTT, NPR1 обнаруживался только в обработанных SA образцах, тогда как при наличии DTT мономеры NPR1 были обнаружены в равных количествах с и без обработки SA [6].

Было установлено, что роль NPR1 в растениях не ограничивается SAR. NPR1 играет важную роль при ограничении роста патогенов. NPR1 также требуется для индуцирования другой защитной устойчивости (ISR), которая вызывается непатогенными, колонизирующими корни бактериями. NPR1 выступает посредником между пересекающимися сигнальными путями салициловой кислоты (SA), жасмоновой кислоты JA и этилена (C2H4), которые вызывают устойчивость к насекомым и некоторым некротрофным патогенам. NPR1 участвует в детоксикации SA и обратной регуляции ее биосинтеза. Кроме того NPR1 участвует в процессах, которые непосредственно не связаны с устойчивостью, например регуляция клеточного деления [6].

2. Объекты и методы исследования

Работа выполнялась на базе кафедры микологии и фитоиммунологии ХНУ им. В. Н. Каразина с 2008 по 2010 годы. Сбор материала проводился на территории Харьковской области в период с 2008 по 2009 годы.

Объектами исследования были изоляты гриба A. alternata f. sp. lycopersici, выделенные из пораженных плодов и листьев томатов. Также объектами исследования были проростки растений томатов.

2.1 Выделение гриба в чистую культуру и подготовка растений к инокуляции

Из пораженных образцов томатов были выделены чистые культуры гриба. Выделение чистой культуры проводилось с использованием стандартных микробиологических методов. Посев осуществлялся в чашках Петри на агаризованную питательную среду – картофельно-глюкозный агар. Также в колбы по 100 мл на жидкую питательную среду Чапека. Семена растений томатов Лагідний и КВС, помещали в стаканчики с универсальной почвой. Дальнейшее исследования проводились с 50 дневными растениями. Опыт осуществлялся в 3-х повторностях.

2.2 Инокуляция растений

А) Инокуляция стеблей

Растения инокулировали в возрасте 8 недель. Для инокуляции растений основной стебель горизонтально срезали стерильным лезвием. Одну высечку мицелия, диаметром 5 мм, аккуратно помещали мицелием вниз на срезанный стебель. Инокулированные растения инкубировали во влажной камере в течение 48 часов. Через два дня зараженные растения помещались в комнату с меньшей влажностью. Длину поражений (в мм) на каждом растении измеряли на 4 и 7 сутки после инокуляции.

Б) Инокуляция листьев

Листья 60 дневных растений томатов, помещались на фильтровальную бумагу в чашки Петри, предварительно смоченную дистиллированной водой, для достижения необходимой влажности. На листья аккуратно помещали капли с суспензией спор (концентрация ……). Инокулированные листья оставляли в чашках Петри на протяжении 48 часов, после чего отмечали появление хлоротических пятен вокруг капель.

В) Оценка поражений на токсичность

Проводились срезы 8 недельных растений томатов под струей воды, затем эти срезы помещались в колбы на 100мл с культуральными фильтратами

A. alternata f. sp. lycopersicy. Растения оставляли в колбах на протяжении 24 часов. После чего наблюдали степень увядания растений томатов.

2.3 Статистическая обработка данных

Статистическая обработка данных проводилась с использованием дисперсионного анализа (р < 0,05). Вычисления проводились при помощи программы Statistica 6.0.

3. Результаты собственных исследований

В ходе проведения исследования нами было выделено в чистую культуру 3 изолята A. alternata f. sp. lycopersicy. Выделение изолятов проводилось из растений томатов.

3.1 Оценка устойчивости растений и вирулентности изолятов гриба при инокуляции листьев

В ходе наших исследований были испытаны различные методы заражения растений и проведена оценка их устойчивости к этому патогену.

При инокуляции стеблей томатов наблюдалось образование некротической зоны от светло-коричневого до черного цвета. (фото С1, С2, С3; КВС1, КВС2, КВС3)

По результатам дисперсионного анализа при инокуляции стеблей двух сортов томатов было установлено, что существует четкая разница между 3-мя изолятами гриба

A. alternata f. sp. lycopersici, между сортами, а также между сутками инокуляции (Табл. 1).

Изолят I более вирулентен, по отношению к изоляту II и III. При заражении стеблей томатов сорта КВС изолятом I некротическая зона на 4 сутки составила 5 мм, а на 7 сутки – 6,25 мм. При заражении сорта КВС изолятом II некротическая зона на 4 сутки составила – 3,5 мм, на 7 сутки – 5,25 мм. При заражении сорта КВС изолятом III некротическая зона на 4 сутки составила 3,5 мм, а на 7 сутки – 4 мм (Рис. 7.).

При заражении стеблей томатов сорта С изолятом I некротическая зона на 4 сутки составила – 5,75 мм, на 7 сутки – 6,5 мм. При заражении стеблей изолятом II, некротическая зона на 4 сутки составила – 5 мм, на 7 сутки – 6,25 мм. При заражении стеблей изолятом III, некротическая зона на 4 сутки составила – 4 мм, на 7 сутки – 5 мм (Рис. 8.).

Сорт С является более восприимчивым, по отношению к сорту КВС (Рис. 9.). Так, средний размер некроза при заражении 3-мя изолятами у сорта С на 4 сутки составил – 4,91 мм, а у сорта КВС – 4 мм. На 7 сутки средний размер некроза при заражении 3-мя изолятами у сорта С составил – 5,91 мм, у сорта КВС – 5,16 мм .

Таблица 1.

Результаты дисперсионного анализа при заражении стеблей томатов

3.2 Оценка устойчивости растений и вирулентности изолятов гриба при инокуляции листьев каплями с суспензией спор

При инокуляции листьев томата сортов КВС и С наблюдалось образование хлоротических пятен на месте нанесения капель. При визуальной оценке мы выявили, что хлороз практически не образовался на листьях сорта КВС, более хорошо выражен на листьях сорта С.

Наибольшая площадь хлротических пятен наблюдалась под действием изолята I (фото)

3.3 Оценка устойчивости растений и вирулентности изолятов гриба при оценке повреждений на токсичность

Таблица 2.

Степень увядания растений томатов сортов КВС и С

Выводы

1. При проведении исследований в чистую культуру были выделены три изолята гриба A. alternata f. sp. lycopersici из пораженных растений томатов.

2. В результате отработки методов заражения на стеблях томатов была установлена четкая разница между изолятами гриба а также сортами. Более вирулентным оказался изолят I, более восприимчивый сорт – С.

3. При инокулировании листьев томатов наблюдалось появление хлоротических пятен. Больше хлоротических областей было на сорте С. Более вирулентным является изолят I.

4. При проверке действия токсинов на растения томатов установлена четкая разница между сортами. Более восприимчив сорт С.

Список использованной литературы

1. Акулов А. Ю. Индуцированная неспецифическая устойчивость растений: история и современность / А. Акулов, Д. Леонтьев. – Х.: Харьковский Национальный университет им. В.Н.Каразина, - 37 с.

2. Демидов Е. С. Методы селекции томата на устойчивость к альтернариозу / Демидов Е. С., Садыкина Е. И., Сайчук А. И. – Приднестровский научно-исследовательский институт сельского хозяйства. – 2006 . – 100 с.

3. Chaerani R. Tomato early blight (Alternaria solani ): the pathogen, genetics, and breeding for resistance / Reni Chaerani, Roeland E. Voorrips // J Jen Plant Pathol. – 2006, 72:335–347

4. Clouse D. Interaction of the asc Locus in F8 Paired Lines of Tomato with A lternaria alternata f. sp. lycopersici and AAL-Toxin / D. Clouse, D.G. Gilchrist // Phytopathology. – 1987. – p. 80-82.

5. Custers J. H.H.V. Engineering disease resistance in plants: дис. Custers Jerфme H.H.V. – W., 2007. – 182 s.

6. Durrant W.E Systemic acquired resistance / W.E. Durrant, X. Dong // Phytopathology. – 2004. – N. 42. – p. 185 – 209.

7. Franklin L. Alternaria Deseases / Laemmlen Franklin // Agriculture and Natural Resources. – 2001.

8. Fritz M. Resistance induction in the pathosystem tomato – Alternaria solani: dissertation: 30.09.05 / Maendy Fritz. – G., 2005. – 124 s.

9. Fungal Databases Nomenclature and Species Banks [Electronic resource]

10. Magan N. Effect of Water Activity and Temperature on Mycotoxin Production by Alternaria alternata in Culture and on Wheat Grain / Naresh Magan, George R. Cayley, John Lacey // Applied and environmental microbiology. – 1984. - Vol. 47, No. 5. - p. 1113-1117.

11. Mesbah. L. A. Sensitivity among species of Solanaceae to AAL toxins produced by Alternaria alternata f.sp. lycopersici / L. A. Mesbah, G. M. van der Weerden, H. J. J. Nijkamp, J. Hille // Plant Pathology. – 2000. - Vol. 49. – p. 734-741.

12. Morisseau C. Multiple Epoxide Hydrolases in Alternaria alternata f. sp. Lycopersici and Their Relationship to Medium Composition andHost-Specific Toxin Production / Christophe Morisseau, Barney L. Ward, David G. Gilchrist, Bruce D. Hammock // Applied and environmental microbiology. – 1999. - Vol. 65, No. 6. - p. 2388–2395.

Характеристики

Список файлов курсовой работы