95230 (598054), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Следует отличать от элементов гриба такие артефакты, возникающие в препаратах, как так называемый «мозаичный гриб» (располагается по границам эпителиальных клеток, состоит из фрагментов органической природы различного размера), удлиненные кристаллы щелочи (полигональная форма); исчезают при промывании препарата, для чего с одной стороны наносят каплю воды, а с другой помещают кусочек фильтровальной бумаги и осторожно, чтобы не потерять материал, повторяют 2-3 раза, капли жира (различные размеры, отсутствие внутренней структуры), нити ваты (размер, гомогенность, неправильная форма, кисточка на конце).
В заключении по микроскопии патологического материала указывают тип поражения волос, наличие или отсутствие мицелия и спор гриба в кожных и ногтевых чешуйках. Однако считают, что гифы дерматофитов в препаратах неотличимы от мицелия дрож-жеподобных или плесневых грибов. Поэтому для определения вида возбудителя нужно сочетать микроскопию патологического материала с получением чистой культуры. При этом образцы патологического материала следует культивировать и при отрицательных результатах микроскопии.
III. Культуральное исследование
Оно необходимо для выделения и идентификации возбудителя, для определения латентного дерматофитоза, носительства дерма-тофитов здоровыми лицами, выявления дерматофитов в окружающей среде и определения чувствительности культуры к химиопрепаратам
3.1 Получение чистой культуры
Исследуемый материал следует максимально измельчить и засевать в минимальных количествах на скошенный агар в пробирках в 2-4 точки на расстоянии 1-2 см. Материалом одной пробы засевают не менее 2-3 пробирок (волосы) и 4-5 пробирок (кожные и ногтевые чешуйки) на две различные питательные среды. Для первичной изоляции дерматофитов предпочтительно использовать стандартную агаршованную среду Сабуро (SDA); 2 или 4 % глюкозы (глюкоза 20 или 40 г, пептон 10 г, агар 20 г, дистиллированная вода до 1000 мл, рН 6,8-7,0), сусло-агар (пивное сусло, разбавленное дистиллированной водой до 7 % углеводов по Баллингу, агар 20 г) или среду Сабуро с антибиотиками: антибактериальные антибиотики (пенициллин: 50 мкг/мл+стрептомицин 50-100 мкг/мл или левомицетин 50 мкг/мл, или биомицин 200 ед/мл, гентамицин) и антиплесневой антибиотик актидион (циклогексимид) 0,1-0,4 мг/мл. Приготовление селективных сред с антибиотиками - 200 000 ед кристаллического пенициллина растворяют в 10 мл стерильной воды, 1 мл этого раствора + 9 мл воды дают концентрацию 2000 мкг/мл. Добавление 2,5 мл этого разведения к 100 мл растопленной и охлажденной до 50° среды дает концентрацию пенициллина 50 мкг/мл. Аналогично производят добавление в среду стрептомицина (1 г стрептомицина=1 млн.ед). Биомицин добавляют растворением 1 таблетки (100000 ед) в 500 мл остывающей среды. Левомицетин предварительно растворяют в 10 мл 70° этилового спирта и добавляют в среду до концентрации 50 мкг/мл. Актидион (антибиотик из Streptomyces griseus) - белый кристаллический порошок, термостабильный, хорошо растворимый в ацетоне. В 1 мл ацетона растворяют 10-50 мг актидиона, доводят до 2 мл дистиллированной водой и прибавляют к 100 мл остывающей среды. Актидион не влияет на рост дерматофитов и подавляет многие плесневые грибы, а также виды Candida и Cryptococcus. Поэтому при подозрении на этилогическую роль этих грибов посевы следует производить также и на среды без актидиона.
Посевы инкубируют в термостате при 25-30-37° соответственно (чаще 30°) и исследуют еженедельно до 4 недель. При подозрении на Т. verrucosum половину засеянных пробирок следует инкубировать при 37°, так как гриб быстрее растет при этой температуре. Первые признаки роста дерматофитов отмечают с 4 по 12 день инкубации в точках посева по краям внесенного материала. При отсутствии роста в течение 30 дней результаты культивирования считают отрицательными. В оптимальных условиях первичные культуры многих дерматофитов можно идентифицировать на 7-10 день после посева, но в случае фавиформных грибов иногда только на 20-30 день. Первичные культуры растут сравнительно медленно и при использовании сред без антибиотиков могут быть подавлены более быстро растущими бактериями и плесневыми грибами. В отличие от последних, колонии дерматофитов никогда не бывают черными, голубыми или зелеными. Важно соблюдать асептику при взятии и хранении материала, а также исследовать его в кратчайший срок. При появлении роста желательно произвести отсев с края первичной культуры на свежую среду для получения чистой культуры. Перед инкубацией засеянные и надписанные чашки Петри следует завернуть в полиэтилен или в бумагу для предотвращения быстрого высыхания и вторичного воздушного загрязнения.
3.2 Идентификация чистой культуры
3.2.1 Характеристика колоний
При описании колоний следует отмечать такие признаки как время появления и скорость роста колонии, ее размеры, цвет поверхности и обратной стороны, характер поверхности и ее рельеф, форму и край колонии, ее консистенцию и наличие врастания в субстрат. Характеризуя колонию, указывают на ее отличия от типичных штаммов, что важно для оценки полиморфизма данного вида гриба, а также для выявления атипичных штаммов и новых, редких в России видов.
3.2.2 Микроскопическое исследование культур
При малом увеличении и сильном освещении можно исследовать край колонии через стекло пробирки, так как нити мицелия перемещаются на стекло. Наличие и расположение характерных морфологических элементов (конидии, спирали) в сочетании с культуральными признаками в раде случаев позволяют предвари-. тельно определить вид без приготовления микропрепарата или микрокультуры. При таком исследовании пробирку можно фиксировать рукой или использовать деревянную подставку с вырезом.
Для приготовления микропрепарата фрагмент культуры расщепляют микологической лопаточкой и препаровальной иглой на предметном стекле в капле жидкости (вода, раствор Люголя, лак-тофенол, этанол+вода 1:1, этанол+глицерин + вода 2:4:4) и накрывают покровным стеклом. Культуру для исследования берут из центральной и периферической зоны колонии. Микроскопировать следует вначале под малым (*8), а затем под большим (*40) увеличением сухой системы микроскопа. Элементы гриба измеряют с помощью окулярного микрометра, значение деления которого предварительно определяют объект-микрометром.
3.2.3 Микрокультуры готовят для исследования микроморфологии гриба с целью «го точной идентификации
На центр покровного стекла наносят каплю жидкой среды, содержащую грибные элементы, и устанавливают его каплей вниз на смазанное вазелином кольцо Вантигема или предметное стекло с лункой. Для предотвращения высыхания на дно вносят каплю воды. Можно приготовить микрокультуры в агаровых блоках. Для этого из агара вырезают квадраты размером 10x10 мм, высотой 2 мм и переносят их на предметное стекло. Культуру засевают посередине каждого ребра агарового квадрата, накрывают его покровным стеклом и промежуток между покровным и предметным стеклом заполняют предварительно расплавленным парафином для предотвращения высыхания. Микрокультуры инкубируют во влажной камере (чашка Петри или эксикатор с увлажненной ватой).
При микроскопической характеристике культур следует учитывать септированность мицелия, наличие, характер и способ прикрепления макроконидий и микроконидий, а также структуру мицелия и его образований - спиралей, гребешковых гифов, фавиче-ских канделябров. Наличие и характер хламидоспор не имеют решающего диагностического значения.
3.2.4 Биохимические дифференциально-диагностические тесты
При невозможности идентифицировать штаммы, основываясь только на их морфологических особенностях, применяют тесты для определения некоторых проявлений метаболической активности грибов. Для лабораторной практики разработаны методы определения питательных потребностей и методы определения ферментативной активности дерматофитов.
Определение потребности в источниках питания и витаминах.
Основную минимальную среду (NH4NO3 1,5 г, глюкоза 40 г; MgS04 • 7НгО 0,5 г; КН2РС>4 1 г; агар Дифко 20 г; дистиллированная вода до 1000 мл) растворяют при нагревании и автоклавируют при 0,5 атм 15 мин. Витамины (тиамин 1 мг, i-инозит 250 мг, L-гистидин 150 мг, никотиновая кислота 10 мг) растворяют в 100 мл дистиллированной воды каждый, автоклавируют при 0,5 атм 15 мин и хранят в холодильнике. Перед опытом 2 мл того или иного витамина добавляют к 100 мл остывающей основной среды. Для определения способности ассимилировать углеводы их вносят в основную среду вместо глюкозы до конечной концентрации 1 %. Источники азотистого питания вносят в среду вместо NH4NO3. Контролем служат посевы на основную и обогащенную среду.
Кератинолитическая активность (Тест перфорации волос).
А) Мелко раздробленную очищенную почву стерилизуют в автоклаве 3 дня подряд по 1 часу при 1 атм. и помещают в чашки Петри ровным слоем в 3-4 мм. На поверхности почвы равномерно и не густо распределяют нарезанные на короткие фрагменты (15-20 мм) детские волосы, простерилизованные в автоклаве 2 дня подряд по 20 мин при 1 атм. На поверхность почвенно-волосяной среды наносят взвесь исследуемой культуры в 1-2 мл дистиллированной воды. Посевы инкубируют 4 недели при 22-27° с еженедельным увлажнением среды стерильной дистиллированной водой. Наличие органов-перфораторов или других форм кератиноли-зиса регистрируют путем еженедельной микроскопии волос, на которых происходит развитие культуры гриба.
Б) Полоску фильтровальной бумаги помещают на дно стерильной чашки Петри и покрывают стерильной дистиллированной водой. Вносят нарезанные стерилизованные волосы, 5-6 капель 1 % дрожжевого экстракта и взвесь исследуемой культуры. Инкубируют при 25° 4 недели. Еженедельно микроскопируют волосы на наличие конических органов - перфораторов волосяного стержня. Данный метод применяют для дифференциации Т. equinum, T. raentagrophytes, T. rubrum, a также для получения совершенных форм дерматофитов из почвы.
Дифференциальная среда с молоком, глюкозой и бромкрезол - пурпурным (ВСР + CCG + 0,5 % дрожжевого экстракта) позволяет дифференцировать виды дерматофитов по двум параметрам: за-щелачивание среды (голубая —> пурпурная) и зона просветления вокруг колоний за счет гидролиза молока.
Гемолитическую активность определяют на среде Сабуро рН 6,5 с фосфатным буфером и с 5 % дефибринированной бараньей крови. Эритроциты вносят в остывающий агар, и среду разливают по чашкам достаточно толстым слоем. После посева исследуемых культур чашки инкубируют 2 недели при 27°. О гемолитической способности судят по образованию вокруг колоний зоны просветления вследствие растворения эритроцитов. Зеленоватую окраску этой зоны расценивают как альфа-гемолиз, наличие прозрачной и бесцветной зоны -как бета - гемолиз. Контролем служат незасеянные чашки с 5 % кро-ч вяным агаром. Тест может служить для дифференциации Т. rubrum и Т. mentagrophytes, а также Т. tonsurans и Т. soudanense.
Определение уреазной активности (способности расщеплять мочевину) производят на среде Христенсена с мочевиной. Состав среды: пептон 1 г, NaCl 5 г, КН2РО4 2 г, глюкоза 5 г, агар 20 г, дистиллированной воды до 1000 г. Ингредиенты среды растворяют при нагревании, рН доводят до 6,8 и добавляют 6 мл 0,2 % раствора фенол красного (0,2 г фенолрота растворяют в 20 мл нагретого этанола и прибавляют 80 мл нагретой дистиллированной воды). Среду стерилизуют 20 мин при 0,5 атм, охлаждают до 50° и добавляют 100 мл водного раствора мочевины (стерилизованного через бактериальный фильтр или 15 мин при 0,5 атм). Среду разливают в пробирки, скашивают и посевы инкубируют 7 дней при 25°-30°. Результаты оценивают по наличию и сроку появления красного окрашивания среды, которое является показателем уреазной активности культур. Контролем служат незасеянные пробирки со средой. Тест применяют для дифференциации атипичных штаммов Т. rubrum и Т. mentagrophytes, а также для идентификации Т. gallinae, «африканских» трихофитонов и некоторых видов Microsporum.
Определение температурного оптимума
Инкубация параллельных посевов при t 25°-30°-37° на скошенном агаре Сабуро. Используется для дифференциации Т. men-tagrophytes и Т. terrestre, а также Т. verrucosum и Т. schonleinii.
IV. Серологические и аллергологические исследования
4.1. Серологические тесты: реакция преципитации в варианте иммунодиффузии в агаровом геле
Сыворотка пациента вносится в центральную лунку, сделанную в агаровом геле, и антигены культур различных видов вносятся в окружающие лунки. Результаты учитываются через 48 и 72 часа инкубации при комнатной температуре и затем через 2-3 дня в холодильнике. Для проверки специфичности линий преципитации в центральную лунку вносится капля 1,5 % ЭДТА, и через 1 час неспецифические линии преципитации исчезают.
4.2 Аллергологические тесты: внутрикожные тесты с трихофи-тином, активным компонентом, которого является галактоманнан-пептид
Углеводный компонент выявляет немедленный тип аллергии (ГНТ), а белковая составляющая связана с выявлением клеточного иммунитета (ГЗТ). Больные, не проявляющие ГЗТ или дающие ГНТ, часто имеют хроническую форму дерматофитоза.
Характеристика и дифференциация основных возбудителей дерматофитозов
Е. floccosum (синонимы Е. inguinale, E. cruris).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
