93311 (597985), страница 5

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 5)

Активность выражают в нмолях окисленного сукцината за 1 мин на 1 мг белка, учитывая, что снижение оптической плотности на 1,0 эквивалентно восстановлению 60 нмолей 2,6-ДХФИФ, а количество восстановленного красителя пропорционально количеству окисленного сукцината.

Содержание отчета

1. Расчет полученных данных представляют в виде таблицы.

Работа 14. Изучение субклеточного распределения глюкозо-6-фосфатазы (маркера микросомальной фракции) в животных тканях

Оборудование и реактивы: центрифуга; печень животного; пипетки; 0,1 М цитратный буфер рН 6,5; 0,08 М раствор глюкозо-6-фосфата (Г-6-Ф) в 0,1 М цитратном буфере****; 10% раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ); раствор молибдата аммония*; восстанавливающий раствор**; стандартный раствор фосфора (5∙10^-5 М)***.

* Приготовление раствора молибдата аммония. 2,5 г молибдата аммония растворяют в 50 мл воды; 14 мл конц. серной кислоты приливают к 200 мл воды. Разбавленную кислоту наливают в раствор молибдата и доводят объем до 1000 мл.

** Приготовление восстанавливающего раствора. К 1,8 г Na₂SO₃ приливают 11,3 мл 1 н HCl и 5 мл воды. Затем растворяют 25 мг 1-амино-2-нафтол-4-сульфокислоты и доводят общий объем до 25 мл. ГОТОВЯТ В ДЕНЬ ОПЫТА.

*** Приготовление стандартного раствора фосфора. 68 мг КН₂РО₄ растворяют в 20 мл воды и добавляют 10 мл конц. серной кислоты и доводят объем до 1000 мл.

**** Приготовление раствора Г-6-Ф. 55 мг глюкозо-6-фосфата растворяют в 2 мл 0,1 М цитратного буфера рН 6,5. ГОТОВЯТ В ДЕНЬ ОПЫТА.

Навеску ткани 2 г переносят в стакан гомогенизатора и добавляют 20 мл среды Б, гомогенизируют. Отбирают 2 мл на определение активности фермента и содержания белка в гомогенате. Центрифугирование и отбор фракций для анализа производят по схеме, приведенной в работе № 11.

Активность глюкозо-6-фосфатазы определяют в исходном гомогенате, ядерной, митохондриальной, лизосомальной, микросомальной и растворимой клеточной фракции по следующей схеме.

Центрифугируют 10 мин при 4000 об/мин. Далее в стеклянных пробирках производят смешение согласно схеме.

Затем в каждую пробирку через промежутки времени, необходимые для дальнейшего колориметрического измерения, приливают по 1 мл восстанавливающего раствора.

Каждую пробу оставляют на 15 мин при комнатной температуре и затем промеряют экстинкцию при 750 нм на ФЭК. Количество белка определяют по Лоури. Активность фермента выражают в ммолях фосфата, отщепленного за 1 мин инкубации на 1 мг белка.

Содержание отчета

1. Обоснуйте наличие в данной методике двух контролей и стандарта.

2. Расчет полученных данных представляют в виде таблицы:

Работа 15. Определение глюкозы в крови человека с использованием ферментных электродов

Оборудование и реактивы: свежая кровь (взятая непосредственно перед определением)*, стеклянные капилляры Roche, автоматический анализатор Roche Omni S 6**.

*Для работы используется капиллярную кровь из пальца. Палец обработать ватой, смоченной медицинским спиртом, произвести прокол скарификатором с помощью автоматической ручки-прокалывателя. Кровь собирать в стеклянный капилляр Roche.

** Перед работой с прибором внимательно ознакомьтесь с его строением и правилами эксплуатации.

В ферментных электродах фермент и электрод образуют единую конструкцию, не требующую для функционирования дополнительных реагентов, кроме буферных растворов. Такие электроды получили название «безреагентных» датчиков, а основанные на их использовании методы анализа называются «безреагентными». Для определения глюкозы используется фермент глюкозооксидаза, иммобилизованная ковалентным связыванием с полупроницаемой поликарбонатной мембраной. Измерение осуществляется с помощью амперометрии. Операционные характеристики электрода остаются стабильными на протяжении двух-четырех недель.

Проведите измерение трех разных образцов крови. Переведите прибор в режим работы с капиллярной кровью. Снимите верхнюю крышку с анализатора для ознакомления с ходом распределения образца крови во время анализа. Поместите капилляр с образцом в диск-приемник (Fill Port). Активируйте всасывание образца. Анализатор автоматически перейдет в режим измерения. Изучите распределение образца крови и прохождение буферных и промывающих растворов. Дождитесь окончания измерения и распечатайте отчет.

Содержание отчета

1. Запишите результаты определений глюкозы в крови.

2. Зарисуйте схемы устройства ферментного электрода и автоматического анализатора.

Работа 16. Определение мочевины в крови человека с использованием ферментных реагентов

Оборудование и реактивы: свежая кровь (взятая непосредственно перед определением)*, стеклянные капилляры Roche, автоматическая пипетка с наконечниками, биохимический анализатор Рефлотрон +.

*Забор крови осуществляется в капилляр, как описано в работе № 14.

** Перед работой с прибором внимательно ознакомьтесь с его строением и правилами эксплуатации.

Биохимический анализатор Рефлотрон предназначен для экспресс-анализа образцов свежей крови и сыворотки человека. Прибор не требует для работы никаких реактивов, кроме тест-полосок для однократного определения исследуемых веществ. Тест-полоска для определения мочевины содержит лиофилизированный фермент уреазу и индикатор в лейко-форме. Образец нагревают, и мочевина, содержащаяся в образце, при 37۫°С расщепляется с образованием аммиака и оксида углерода. Это ведет к частичной смене окраски индикатором на зелено-голубую, интенсивность которой прямо пропорциональна количеству мочевины в пробе:

(NH₂)₂CO + H₂O = 2 NH₃ + CO₂

NH₃ + индикатор (бесцветный) = NH₄⁺ + индикатор (сине-зеленый).

После 3 минут, необходимых для инкубации образца, измеряется оптическая плотность по принципу рефлексионной фотометрии. На тест-полоске имеется магнитная лента с информацией об анализе. Прибор считывает информацию об анализе и пересчитывает оптическую плотность в концентрацию.

Приготовьте тест-полоску для анализа. Удалите с ее поверхности защитную алюминиевую полоску. Дозатором отмерьте 32 мкл образца и нанесите его в центр зоны аппликации, не касаясь наконечником тест-полоски. Откройте крышку прибора и поместите тест-полоску в анализируемую зону. Закройте крышку. Анализатор автоматически перейдет в режим измерения. Дождитесь окончания измерения и распечатайте отчет.

Содержание отчета

1. Запишите результаты определений мочевины в крови.

Работа 17. Иммуноферментное определение тестостерона в сыворотке крови

Оборудование и реактивы: сыворотка крови человека, автоматическая пипетка с наконечниками, набор стандартных растворов тестостерона с известными концентрациями, иммуноферментный коньюгат, субстратный раствор, стоп-раствор, стрипы с иммобилизованными моноклональными антителами к тестостерону, инкубатор для планшет, вошер для планшет, иммуноферментный ридер планшет.

Тест-система ИФА для определения тестостерона основана на принципе конкурентного связывания. Лунки микротитра покрыты антителом к уникальному антигенному сайту на молекуле тестостерона. Эндогенный тестостерон в пробе конкурирует с конъюгатом тестостерона и пероксидазы хрена за связывание с антителом, которое сорбировано на микропанелях. После инкубации несвязавшийся конъюгат смывается. Количество связавшегося конъюгата обратно пропорционально концентрации тестостерона в образце. При добавлении субстратного раствора интенсивность полученного окрашивания обратно пропорциональна концентрации тестостерона в сыворотке.

Характеристики

Список файлов книги