93311 (597985), страница 4
Текст из файла (страница 4)
60 мин при 20000g
Осадок (лизосом. фр.)
ресуспендируют в среде А и доводят объем до 18мл
Осадок (микросомальная фр.)
ресуспендируют в среде А и доводят объем до 18мл
Конечный
супернатант
Ресуспендирование проводят гомогенизированием полученных осадков в 4-6 мл среды гомогенизации (б), затем полученную суспензию переносят количественно в мерный цилиндр на 20 мл и объем суспензии доводят до 18 мл; таким образом, концентрация субклеточных структур достигает исходной (как в гомогенате) концентрации.
Активность ДНКазы определяют в исходном гомогенате, ядерной, митохондриальной, лизосомальной, микросомальной и растворимой клеточной фракции по следующей схеме.
| 1 мл раствора ДНК (1 мг/мл) |
| 1 мл 0,01% раствора крезолового красного |
| 1 мл буфера А |
| Преинкубация 8 минут при 37 °С |
| 1 мл нагретого раствора фракции |
Смесь быстро переливают в фотометрическую кювету (L=1 см) и измеряют оптическую плотность на ФЭК при 590 нм против буфера А. После измерения смесь немедленно переливают в исходную пробирку и инкубируют 20 мин при 37°С. Измеряют оптическую плотность системы после инкубации. Количество белка определяют по Лоури.
Содержание отчета
1. Расчет полученных данных представляют в виде таблицы.
| Фракции | Г | Я | ТМ | ЛМ | Р | С | ||||||
| Анализируемые пробы | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | ||||||
| Оптическая плотность, в каждой параллели и среднее | ||||||||||||
| Аоп – Акн | ||||||||||||
| Активность на 1 мг ткани | ||||||||||||
| Активность фракции в % от гомогената | 100 % | |||||||||||
| Количество белка на 1 мг ткани | ||||||||||||
| Белок в % от белка гомогената | 100 % | |||||||||||
| Относительная удельная активность фракций | ||||||||||||
Работа 12. Изучение субклеточного распределения кислых протеаз (ферментов-маркеров лизосом) в животных тканях
Оборудование и реактивы: центрифуга; печень животного; пипетки; 0,01 М фосфатный буфер, содержащий 0,32 М сахарозы, рН 7,55; 100 мМ натрий-ацетатный буфер рН 3,3; 8% раствор гемоглобина; 5% раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ); тирозин кристаллический; 0,32 М р-р сахарозы, содержащий 0,01 М трис-буфер рН 7,4 (среда А); 0,32 М р-р сахарозы, содержащий 0,01 μМ MgCl2∙6H2O рН 5,0 (среда Б).
Навеску ткани 2 г переносят в стакан гомогенизатора и добавляют 20 мл среды Б, гомогенизируют. Отбирают 2 мл на определение активности фермента и содержания белка в гомогенате. Центрифугирование и отбор фракций для анализа производят по схеме, приведенной в работе № 11.
Активность кислых протеаз определяют в исходном гомогенате, ядерной, митохондриальной, лизосомальной, микросомальной и растворимой клеточной фракции по следующей схеме.
| опыт | контроль |
| 200 мкл фракции | 200 мкл фракции |
| 600 мкл NaAc буфера, рН 3,3 | 800 мкл NaAc буфера, рН 3,3 |
| Преинкубация 8 минут при 37°С | |
| 200 мкл 8% раствора гемоглобина | – |
| Инкубация 40 минут при 37°С | |
| 1 мл 5 % ТХУ | 1 мл 5 % ТХУ |
Пробы центрифугируют 30 мин при 4000 об/мин. Отбирают 1 мл надосадочной жидкости и определяют количество образовавшегося тирозина спектрофотометрически при 280 нм. Количество белка в супернатанте определяют спектрофотометрически при 280 нм. Активность фермента определяют по калибровочному графику.
Построение калибровочного графика
Готовят рабочий раствор тирозина с концентрацией 100 мкг/мл. Затем производят его разведение в соответствии со схемой.
| № пробирки | V р-ра тир | V р-ра воды | Конц, мкг/мл | Dср |
| 1 | 0,5 | 4,5 | ||
| 2 | 1 | 4 | ||
| 3 | 1,5 | 3,5 | ||
| 4 | 2,0 | 3 | ||
| 5 | 2,5 | 2,5 | ||
| 6 | 3,0 | 2,0 | ||
| 7 | 3,5 | 1,5 | ||
| 8 | 4,0 | 1,0 | ||
| 9 | 4,5 | 0,5 | ||
| 10 | 5,0 | 0,0 |
Содержание отчета
1. Расчет полученных данных представляют в виде таблицы.
| Фракции | Г | Я | ТМ | ЛМ | Р | С | ||||||
| Анализируемые пробы | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | ||||||
| Оптическая плотность, в каждой параллели и среднее | ||||||||||||
| Аоп – Акн | ||||||||||||
| Количество тирозина по калибровочной кривой | ||||||||||||
| Активность на 1 мг ткани | ||||||||||||
| Активность фракции в % от гомогената | 100% | |||||||||||
| Количество белка на 1 мг ткани | ||||||||||||
| Белок в % от белка гомогената | 100% | |||||||||||
| Относительная удельная активность фракций | ||||||||||||
Работа 13. Изучение субклеточного распределения сукцинатдегидрогеназы (маркера митохондрий) в животных тканях
Оборудование и реактивы: центрифуга; печень животного; пипетки; буфер фосфатный 0,067 М (субстратный), рН 7,55; 0,5 М раствор сукцината натрия в субстратном буфере; 0,32 М р-р сахарозы, содержащий 0,01 М трис-буфер рН 7,4 (среда А); 0,32 М р-р сахарозы, содержащий 0,01 μМ MgCl2∙6H2O рН 5,0 (среда Б); 0,02 М раствор феназинметасульфата*; 0,001 М раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ)**.
* Приготовление раствора феназинметасульфата. 12 мг вещества переносят в стеклянную пробирку, добавляют 2 мл дистиллированной воды, закрывают пробкой и перемешивают. РЕАКТИВ ГОТОВЯТ В ДЕНЬ ОПЫТА.
** Приготовление раствора ДХФИФ. 17 мг вещества растворяют в колбе на 50 мл. РЕАКТИВ ГОТОВЯТ В ДЕНЬ ОПЫТА.
Навеску ткани 2 г переносят в стакан гомогенизатора и добавляют 20 мл среды Б, гомогенизируют. Отбирают 2 мл на определение активности фермента и содержания белка в гомогенате. Центрифугирование и отбор фракций для анализа производят по схеме, приведенной в работе № 11.
Активность сукцинатдегидрогеназы определяют в исходном гомогенате, ядерной, митохондриальной, лизосомальной, микросомальной и растворимой клеточной фракции по одной из следующих схем:
а) кинетическая схема определения активности.
| опыт | контроль |
| 400 мкл субстратного буфера | 600 мкл субстратного буфера |
| 200 мкл сукцината натрия на субстратном буфере | – |
| 200 мкл 0,02 М феназинметасульфата | 200 мкл 0,02 М феназинметасульфата |
| 200 мкл 0,001 М ДХФИФ НЕПОСРЕДСТВЕННО ПЕРЕД ОПЫТОМ | 200 мкл 0,001 М ДХФИФ НЕПОСРЕДСТВЕННО ПЕРЕД ОПЫТОМ |
| Инкубация на водяной бане 3 мин при 37 °С | |
| 3 мл фракции, НАГРЕТОЙ ДО 37 °С | 3 мл фракции, НАГРЕТОЙ ДО 37 °С |
Смесь быстро перемешивают и немедленно переливают в кювету (l = 1 см), на секундомере отмечают время начала реакции. Измеряют оптическую плотность системы на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре при 600 нм каждые 20 сек в течении 3 мин. Аналогичным образом измеряют снижение оптической плотности в контрольных пробах, не содержащих сукцината. Белок определяют по Лоури. При расчете истинной активности сукцинатдегидрогеназы величины эндогенной активности вычитают из величин, выражающих активность сукцинатдегидрогеназы в пробах, содержащих сукцинат.
Активность выражают в нмолях окисленного сукцината за 1 мин на 1 мг белка, учитывая, что снижение оптической плотности на 1,0 эквивалентно восстановлению 60 нмолей 2,6-ДХФИФ, а количество восстановленного красителя пропорционально количеству окисленного сукцината.
б) стационарная схема определения активности.
| опыт | контроль |
| 400 мкл субстратного буфера | 600 мкл субстратного буфера |
| 200 мкл сукцината натрия на субстратном буфере | – |
| 200 мкл 0,02 М феназинметасульфата | 200 мкл 0,02 М феназинметасульфата |
| 200 мкл 0,001 М ДХФИФ НЕПОСРЕДСТВЕННО ПЕРЕД ОПЫТОМ | 200 мкл 0,001 М ДХФИФ НЕПОСРЕДСТВЕННО ПЕРЕД ОПЫТОМ |
| Инкубация на водяной бане 3 мин при 37 °С | |
| 3 мл фракции, НАГРЕТОЙ ДО 37 °С | 3 мл фракции, НАГРЕТОЙ ДО 37 °С |
| Инкубация на водяной бане 30 мин при 37°С | |
| 1 мл 1 н HCl | 1 мл 1 н HCl |
Затем пробы переливают в центрифужные пробирки и центрифугируют 10 мин про 4000 об/мин. Измеряют оптическую плотность системы на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре при 600 нм. Белок определяют по Лоури. При расчете истинной активности сукцинатдегидрогеназы величины эндогенной активности вычитают из величин, выражающих активность сукцинатдегидрогеназы в пробах, содержащих сукцинат.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
