10072 (596828), страница 2

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 2)

Понятие «апоптоз» было введено при изучении гибели части клеток печени при неполной перевязке портальной вены. При этом наблюдается своеобразная картина клеточной смерти, которая затрагивает лишь отдельные клетки в паренхиме печени.

Процесс начинается с того, что соседние клетки теряют контакты, они как бы сморщиваются (первоначальное название этой формы гибели shrinkage necrosis – некроз сжатием клетки), в ядрах по их периферии происходит специфическая конденсация хроматина, затем ядро фрагментируется на отдельные части, вслед за этим сама клетка фрагментируется на отдельные тельца, отграниченные плазматической мембраной, – апоптические тельца.

Апоптоз – процесс, приводящий не к лизису, не к растворению клетки, а к ее фрагментации, распаду. Судьба апоптических телец тоже необычна: они фагоцитируются макрофагами или даже нормальными соседними клетками. При этом не развивается воспалительная реакция.

Важно отметить, что во всех случаях апоптоза – во время ли эмбрионального развития, во взрослом ли организме, в норме или при патологических процессах – морфология процесса гибели клеток очень сходна. Это может говорить об общности процессов апоптоза в разных организмах и в разных органах.

Исследования на разных объектах показали, что апоптоз есть результат реализации генетически запрограммированной клеточной гибели. Первые доказательства наличия генетической программы клеточной смерти (ПКС) были получены при изучении развития нематоды Caenorhabditis elegans. Этот червь развивается всего за трое суток, и его малые размеры позволяют проследить за судьбой всех его клеток, начиная с ранних этапов дробления до половозрелого организма.

Оказалось, что при развитии Caenorhabditis elegans образуется всего 1090 клеток, из которых часть нервных клеток в количестве 131 штуки спонтанно погибает путем апоптоза и в организме остается 959 клеток. Были обнаружены мутанты, у которых процесс элиминации 131 клетки был нарушен. Были выявлены два гена сеd‑3 и сеd‑4, продукты которых вызывают апоптоз 131 клетки. Если у мутантных Caenorhabditis elegans эти гены отсутствуют или изменены, то апоптоз не наступает и взрослый организм состоит из 1090 клеток. Был найден и другой ген – сеd‑9, который является супрессором апоптоза: при мутации сеd‑9 все 1090 клеток погибают. Аналог этого гена был обнаружен у человека: ген bcl‑2 также является супрессором апоптоза различных клеток. Оказалось, что оба белка, кодируемые этими генами, – Сеd‑9 и Вс1–2, имеют один трансмембранный домен и локализуются во внешней мембране митохондрий, ядер и эндоплазматического ретикулума.

Система развития апоптоза оказалась очень сходной у нематоды и позвоночных животных, она состоит из трех звеньев: регулятора, адаптера и эффектора. У Caenorhabditis elegans регулятором является Сеd‑9, который блокирует адаптерный белок Сеd‑4, который в свою очередь не активирует эффекторный белок Сеd‑3, протеазу, которая действует на белки цитоскелета и ядра (табл. 16).

Табл. 16. Развитие программируемой клеточной смерти (апоптоза)

Знак ──┤ – торможение процесса‚ знак ─→ – стимуляцию процесса

У позвоночных система ПКС более сложная. Здесь регулятором является белок Вс1–2, который ингибирует адаптерный белок Apaf‑1, стимулирующий каскад активации специальных протеиназ – каспаз.

Ферменты – участники процесса апоптоза

Таким образом,

• раз начавшись в клетке, такая деградация быстро протекает «до конца»;

• в апоптоз вступают не все клетки сразу или в короткий промежуток времени, а постепенно;

• разрывы ДНК происходят по линкерной (межнуклеосомной) ДНК;

• деградацию осуществляют эндо-, но не экзонуклеазы, и эти эндонуклеазы активируются или получают доступ к ДНК не в результате непосредственного взаимодействия с агентом, вызывающим апоптоз, а опосредованно, так как от момента контакта клеток с таким агентом до начала развития деградации проходит довольно значительное время, и, следовательно, фрагментация ДНК не является первой характерной «апоптотической» реакцией клетки на молекулярном уровне. В самом деле, если бы деградация запускалась в результате непосредственного взаимодействия эндонуклеаз или хроматина с агентом, то в случае, например, действия ионизирующей радиации апоптоз происходил бы быстро и одновременно почти во всех клетках.

• Исходя из этих заключений, расшифровка молекулярного механизма развития апоптоза «сосредоточилась» на идентификации эндонуклеаз(ы), осуществляющих фрагментацию ДНК, и механизмов, активирующих эндонуклеазы.

Эндонуклеазы

1. Деградацию осуществляет ДНКаза I. Процесс активируется Са2+ и Мg2+ [1979] и подавляется Zn2+ [1984].

Однако имеются факты, которые свидетельствуют против участия ДНКазы I в процессе фрагментации ДНК. Так известно, что этот фермент отсутствует в ядре, правда, этот аргумент не очень весомый, так как относительно небольшой размер его молекул, 31 кДа, в случае нарушения проницаемости ядерной мембраны делает участие ДНКазы I в деградации ДНК вполне реальным. Другое дело, что при обработке хроматина in vitro ДНКаза I вызывает разрывы не только в линкерной части, но и в нуклеосомной ДНК.

2. Другой эндонуклеазой, рассматриваемой в качестве основного фермента деградации ДНК, является эндонуклеаза II [Барри 1993]. Эта нуклеаза при обработке ядер и хроматина осуществляет межнуклеосомную фрагментацию ДНК. Несмотря на то, что его активность не зависит от ионов двухвалентных металлов, вопрос об участии эндонуклеазы II в деградации ДНК не снят до сих пор, поскольку фермент не только находится в лизосомах, но и выделяется из ядер клеток.

3. эндонуклеаза с молекулярной массой 18 кДа. Этот фермент был выделен из ядер погибающих путем апоптоза тимоцитов крыс [Гайдо, 1991]. Она отсутствовала в нормальных тимоцитах. Активность фермента проявляется в нейтральной среде и зависит от Са2+ и Мg2+.

4. γ-нуклеаза с молекулярной массой 31 кДа, имеющая «классическую» зависимость от ионов Са, Мg и Zn. Активность этого фермента повышалась в ядрах тимоцитов крыс, обработанных глюкокортикоидами [1994].

5. эндонуклеаза с молекулярной массой 22,7 кДа фермент, активность которого проявляется в ядрах тимоцитов крыс только после действия глюкокортикоидов и подавляется теми же ингибиторами, что и межнуклеосомная деградация ДНК [1993].

Каспазы

Каспазы – цистеиновые протеазы, которые расщепляют белки по аспарагиновой кислоте. В клетке каспазы синтезируются в форме латентных предшественников – прокаспаз. Существуют инициирующие и эффекторные каспазы. Инициирующие каспазы активируют латентные формы эффекторных каспаз. Субстратами для действия активированных каспаз служат более 60 различных белков. Это, например, киназа фокальных адгезионных структур, инактивация которой приводит к отделению апоптических клеток от соседей; это ламины, которые при действии каспаз разбираются; это цитоскелетные белки (промежуточные филаменты, актин, гельзолин), инактивация которых приводит к изменению формы клетки и к появлению на ее поверхности пузырей, которые дают начало апоптическим тельцам; это активируемая протеаза САD, которая расщепляет ДНК на олигонуклеотидные нуклео-сомные фрагменты; это ферменты репарации ДНК, подавление которых предотвращает восстановление структуры ДНК, и многие другие.

Одним из примеров разворачивания апоптозного ответа может являться реакция клетки на отсутствие сигнала от необходимого трофического фактора, например фактора роста нервов (NGF), или андрогена.

В цитоплазме клеток в присутствии трофических факторов находится в неактивной форме еще один участник реакции – фосфорилированный белок Ваd. В отсутствие трофического фактора этот белок дефосфорилируется и связывается с белком Вс1–2 на внешней митохондриальной мембране и этим ингибирует его антиапоптозные свойства. После этого активируется мембранный проапоптический белок Вах, открывая путь ионам, входящим в митохондрию. В это же время из митохондрий через образовавшиеся в мембране поры в цитоплазму выходит цитохром с, который связывается с адаптерным белком Араf‑1, который в свою очередь активирует прокаспазу 9. Активированная каспаза 9 запускает каскад других прокаспаз, в том числе каспазу 3, которые, будучи протеиназами, начинают переваривать мешенные белки (ламины, белки цитоскелета и др.), что вызывает апоптическую смерть клетки, ее распад на части, на апоптические тельца.

Апоптические тельца, окруженные плазматической мембраной разрушенной клетки, привлекают отдельные макрофаги, которые их поглощают и переваривают с помощью своих лизосом. Макрофаги не реагируют на соседние нормальные клетки, но узнают апоптические. Это связано с тем, что при апоптозе нарушается асимметрия плазматической мембраны и на ее поверхности появляется фосфатидилсерин, негативно заряженный фосфолипид, который в норме располагается в цитозольной части билипидной плазматической мембраны. Таким образом, путем избирательного фагоцитоза ткани как бы очищаются от погибших апоптозных клеток.

Как указывалось выше, апоптоз может быть вызван целым рядом внешних факторов, таких как радиация, действие некоторых токсинов, ингибиторов клеточного метаболизма. Необратимые повреждения ДНК вызывают апоптоз. Это связано с тем, что накапливающийся транскрипционный фактор – белок р53, не только активирует белок р21, который ингибирует зависящую от циклина киназу и останавливает клеточный цикл в G1- или G2‑фазе, но и активирует экспрессию гена bax, продукт которого запускает апоптоз.

Наличие контрольных точек в клеточном цикле необходимо для определения завершения его каждой фазы. Остановка клеточного цикла происходит при повреждении ДНК в G1 периоде, при неполной репликации ДНК в S‑фазе, при повреждении ДНК в G2‑периоде и при нарушении связи веретена деления с хромосомами.

Одним из контрольных пунктов в клеточном цикле является собственно митоз, который не переходит в анафазу при неправильной сборке веретена и при отсутствии полных связей микротрубочек с кинетохорами. В этом случае не происходит активации АРС-комплекса, не происходит деградации когезинов, соединяющих сестринские хрома-тиды, и деградации митотических циклинов, что необходимо для перехода в анафазу.

Повреждения ДНК препятствуют вхождению клеток в S‑период или в митоз. Если эти повреждения не катастрофические и могут быть восстановлены за счет репаративного синтеза ДНК, то блок клеточного цикла снимается, и цикл доходит до своего завершения. Если же повреждения ДНК значительные, то каким-то образом происходят стабилизация и накопление белка р53, концентрация которого в норме очень низкая из-за его нестабильности. Белок р53 является одним из факторов транскрипции, который стимулирует синтез белка р21, являющегося ингибитором комплекса СDК-циклин. Это приводит к тому, что клеточный цикл останавливается на стадии G1или G2. При блоке в G1‑периоде клетка с повреждением ДНК не вступает в S‑фазу, так как это могло бы привести к появлению мутантных клеток, среди которых могут быть и опухолевые клетки. Блокада в G2‑периоде также предотвращает процесс митоза клеток с повреждениями ДНК. Такие клетки, с блокированным клеточным циклом, в дальнейшем погибают путем апоптоза, программированной клеточной гибели (рис. 353).

При мутациях, приводящих к потере генов белка р53, или при их изменениях, блокады клеточного цикла не происходит, клетки вступают в митоз, что приводит к появлению мутантных клеток, большая часть из которых нежизнеспособна, другая – дает начало злокачественным клеткам.

Избирательные повреждения митохондрий, при которых в цитоплазму высвобождается цитохром с, также являются частой причиной развития апоптоза. Особенно митохондрии и другие клеточные компоненты страдают при образовании токсически активных форм кислорода (АТК), под действием которых во внутренней мембране митохондрий образуются неспецифические каналы с высокой проницаемостью для ионов, в результате чего матрикс митохондрий набухает, а внешняя мембрана разрывается. При этом растворенные в межмембранном пространстве белки вместе с цитохромом с выходят в цитоплазму. Среди освободившихся белков есть факторы, активирующие апоптоз, и прокаспаза 9.

Многие токсины (рицин, дифтерийный токсин и др.), а также антиметаболиты могут вызывать гибель клеток путем апоптоза. При нарушении синтеза белка в эндоплазматическом ретикулуме в развитии апоптоза участвует локализованная там прокаспаза 12, которая активирует ряд других каспаз, и в том числе каспазу 3.

Элиминация – удаление отдельных клеток путем апоптоза, наблюдается и у растений. Здесь апоптоз включает в себя, так же как у животных клеток, фазу индукции, эффекторную фазу и фазу деградации. Морфология гибели клеток растений сходна с изменениями клеток животных: конденсация хроматина и фрагментация ядра, олигонуклеотидная деградация ДНК, сжатие протопласта, его дробление на везикулы, разрыв плазмодесм и т.д. Однако везикулы протопласта разрушаются гидролазами самих везикул, так как у растений нет клеток, аналогичных фагоцитам. Так, ПКС происходит при росте клеток корневого чехлика, при формировании перфораций у листьев, при образовании ксилемы и флоэмы. Опадание листьев связано с избирательной гибелью клеток определенной зоны черенка.

Характеристики

Список файлов книги