11131 (567507)

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла

Кинетика действия ферментов

Кинетические исследования ферментативных реакций необходимы не только для количественного определения ферментов и сравнения скоростей их функционирования, но, в еще большей степени, для расшифровки механизмов ферментативных реакций. В этих целях, прежде всего, необходимо уметь корректно вычислять кинетические параметры ферментативных реакций, оценивать конкурентный или неконкурентный характер действия ингибиторов. Рассмотрим основные уравнения, описывающие ферментативную кинетику и способы вычислений. Основное внимание будет уделено не строгости математического вывода уравнений, а правильному их использованию для получения достоверных результатов.

При выводе кинетических уравнений количественно характеризующих ферментативную активность, обычно делают следующие допущения.

1. Фермент и субстрат образуют фермент-субстратный комплекс за счет сил физической природы. Из этого комплекса в дальнейшем освобождаются фермент и продукт. Таким образом, химической реакцией является только второй этап – распад фермент-субстратного комплекса:

2. Концентрация субстрата обычно значительно выше концентрации фермента. Поэтому при рассмотрении начальных скоростей реакции, когда

3. Константа диссоциации определяется соотношением:

концентрация продукта очень низка, обратимостью второй стадии можно пренебречь. Следовательно, – const., а скорость образования продукта равна:

Поскольку общая концентрация фермента равна сумме концентраций свободного фермента и фермента, связанного в комплекс, то + или = –.

Подставляя значение [Е] = [Е₀] — [ES] из (4), получаем:

С другой стороны, из уравнения следует:

В уравнении выражение к₊₂ можно рассматривать как максимальную скорость, достигаемую, когда концентрация фермент-субстратного комплекса численно равна общей концентрации фермента. Следовательно:

Выражение есть не что иное, как уравнение Михаэлиса–Ментен для ферментативной кинетики, а величина К_га = K_s представляет собой меру сродства фермента к субстрату. Численно она равна такой концентрации субстрата, при которой начальная скорость ферментативной реакции составляет половину максимальной скорости. Уравнение графически выражается гиперболой.

Для практического определения кинетических параметров этот график неудобен, к тому же требует использования концентраций субстрата, «насыщающих» фермент, что не всегда достижимо при ограниченной растворимости субстрата. Поэтому обычно стремятся преобразовать уравнение Михаэлиса–Ментен в такую форму, чтобы графически оно изображалось прямой линией. Чаще всего для этого используют метод Лайнуивера–Берка, представляя уравнение Михаэлиса–Ментен в виде уравнения прямой линии:

Последнее выражение называют уравнением Лайнуивера–Берка и для расчета кинетических параметров используют график, построенный в координатах: 1/V против 1/S. В результате получается прямая, отсекающая на оси ординат отрезок, равный 1/V, а на продолжении оси абсцисс отрезок, равный – 1/К_га. Однако следует отметить, что при использовании графика Лайнуивера–Берка точки в области высоких концентраций субстрата располагаются слишком густо, а положение прямой линии во многом зависит от точек в области низких концентраций субстрата, где определение скорости менее надежно. Кроме того, реальные экспериментальные данные не всегда адекватно аппроксимируются в виде прямой линии.

Поэтому предложено еще несколько приемов для определения кинетических параметров. Метод Эди–Хофсти также основан на преобразовании уравнения Михаэлиса–Ментен. Умножив обе части уравнения на и преобразовав, получим:

График этого уравнения в координатах V против V/S представляет собой прямую линию, отсекающую на осях ординат и абсцисс отрезки, равные V_maxH V_m>x/ К_го соответственно.

В некоторых случаях для вычисления кинетических параметров удобнее использовать метод Эйзенталя и Корниш–Боуден, основанный на преобразованном уравнении Михаэлиса–Ментен:

В этом случае для каждого значения V и S строится прямая в координатах V и S. Точка пересечения всех этих прямых имеет координаты: V_max и К_т.

Ингибирование ферментов

Изучение подавления активности ферментов служит одним из способов расшифровки механизма их действия. Подходом к решению последней задачи является изучение специфичности действия ферментов. В свою очередь, это требует корректного измерения кинетических параметров в присутствии изучаемого аналога субстрата. Рассмотрим способы определения характера взаимоотношений субстратов, их аналогов и ингибиторов ферментативной активности путем вычисления ряда кинетических параметров.

При этом, если константа диссоциации комплекса K_s = K_m равна:

Ингибиторы ферментов можно разделить на две основные группы: обратимые и необратимые. После удаления ингибитора первого типа активность фермента восстанавливается; во втором случае ингибитор удалить не удается или активность фермента не восстанавливается даже после удаления ингибитора. Необратимое ингибирование достигает максимума, когда весь фермент связан с ингибитором. Обратимое ингибирование достигает состояния равновесия, положение которого определяется константой ингибирования, характеризующей сродство фермента к ингибитору. Схема обратимого ингибирования приведена ниже:

При конкурентном ингибировании субстрат и ингибитор связываются с одним и тем же активным центром фермента. В присутствии ингибитора снижается сродство фермента к субстрату. Величина не изменяется, так как при «насыщающей» концентрации субстрат вытесняет ингибитор из комплекса с ферментом.

При неконкурентном ингибировании субстрат и ингибитор связываются с разными центрами фермента. При этом величина К_га не изменяется, а величина V_max снижается.

Возможны также промежуточные или альтернативные случаи, например, когда ингибитор связывается не с ферментом, а с фермент-субстратным комплексом, как в случае бесконкурентного ингибирования, при котором изменяются оба кинетических параметра.

Для определения типа ингибирования обычно используют график Лайнуивера–Берка, полученный для данного субстрата в отсутствие и в присутствии ингибитора.

При конкурентном ингибировании, если определена величина К_т в присутствии ингибитора, можно рассчитать константу ингибирования по следующей формуле:

При неконкурентном ингибировании с помощью определения измененной величины V можно рассчитать К. по следующей формуле:

Все биохимические процессы в клетке взаимосвязаны и взаимозависимы, тем не менее часть из них преимущественно выполняет функцию построения клеточного материала, а часть – снабжения источниками энергии этих «строительных работ». Поэтому принято разделять биохимические процессы на два основных типа: ассимиляционные, называемые анаболизмом, включающим синтез низкомолекулярных предшественников и построения из них молекул биополимеров, и диссимиляционные, называемые катаболизмом, состоящим в обеспечение источника энергии, «энергетического привода», приводящего в движение анаболизм.

Рассмотрим основные механизмы процессов трансформации энергии в клетке, т.е. механизмы катаболических процессов.

Пути и механизмы преобразования энергии в живых системах

Главная задача энергетического метаболизма – аккумуляция энергии, полученной в результате окислительно-восстановительных превращений субстратов в такую форму, которая может быть использована для роста клеток и осуществления всех их функций.

Основными формами аккумуляции энергии в клетках являются трансмембранная разность электрохимических потенциалов ионов, а также «макроэргические» химические соединения.

В клетках, как и в неживых системах, самопроизвольно протекают только те химические процессы, которые приводят к уменьшению свободной энергии системы, т.е. той доли общей энергии, которая может быть превращена в работу. Такие реакции называют экзэргоническими. Напротив, если ДОО, то реакция не может протекать самопроизвольно, так как требует притока энергии.

Уравнение Гиббса описывает взаимосвязь между свободной энергией, энтальпией и энтропией.

Кратко рассмотрим основные уравнения химической термодинамики.

где ДН – изменение энтальпии; AS – изменение энтропии.

При реакциях в растворах изменение свободной энергии определяется уравнением:

где R – газовая постоянная; Т – абсолютная температура;

– константа равновесия химической реакции.

При стандартных условиях каждая химическая реакция характеризуется свободной энергией, вычисляемой по формуле:

AG° = -2,303 RT lgK или AG = -1,363 lgK_eq ккал/моль^-1 при 25C.

При окислительно-восстановительных реакциях изменение свободной энергии определяется уравнением:

где п – количество перенесенных электронов:

F – число Фарадея: заряд одного моля электронов; Е «' – стандартный окислительно-восстановительный потенциал для окислителя и восстановителя, В.

Эти уравнения удобно применять при расчетах. Например, можно подсчитать, сколько энергии выделяется в результате дыхания;

Таким образом, AG = 2 • 23062 кал • моль^-1 - В-[0,815 - (-0,32)] В = 52351 кал/моль.

Классификация энергетических процессов

Энергетические процессы в нефототрофных организмах подразделяются на аэробные и анаэробные в зависимости от участия или не участия в них молекулярного кислорода.

Аэробное дыхание – энергетический процесс, при котором конечным акцептором электронов окисляемого субстрата, передающихся по электрон-транспортной цепи, является молекулярный кислород.

В анаэробном дыхании конечными акцепторами электронов становятся другие окислители: нитрат-, сульфат-анионы, катионы металлов, органические вещества.

Брожение – энергетический процесс, при котором электроны передаются непосредственно от донора к акцептору без участия электрон-транспортной цепи: гликолиз, молочнокислое брожение и др.

Перечисленные процессы можно классифицировать на основе механизма образования АТР, являющегося основным макроэр-гическим соединением, запасающим энергию в своих химических связях. Различают образование АТР в результате переноса электронов по дыхательной цепи – окислительное фосфорилирование, а также образование АТР в процессах, не связанных с переносом электронов по цепи – субстратное фосфорилирование. В настоящее время первый тип процессов правильнее называть образованием АТР за счет трансформации энергии трансмембранного электрохимического потенциала или сокращенно – мембранным фос-форилированием.

У фототрофных организмов основным способом запасания энергии является фо-тофосфорилирование, т.е. образование АТР за счет трансформации энергии ТЭП, формируемого путем утилизации световой энергии.

Характеристики

Тип файла документ

Документы такого типа открываются такими программами, как Microsoft Office Word на компьютерах Windows, Apple Pages на компьютерах Mac, Open Office - бесплатная альтернатива на различных платформах, в том числе Linux. Наиболее простым и современным решением будут Google документы, так как открываются онлайн без скачивания прямо в браузере на любой платформе. Существуют российские качественные аналоги, например от Яндекса.

Будьте внимательны на мобильных устройствах, так как там используются упрощённый функционал даже в официальном приложении от Microsoft, поэтому для просмотра скачивайте PDF-версию. А если нужно редактировать файл, то используйте оригинальный файл.

Файлы такого типа обычно разбиты на страницы, а текст может быть форматированным (жирный, курсив, выбор шрифта, таблицы и т.п.), а также в него можно добавлять изображения. Формат идеально подходит для рефератов, докладов и РПЗ курсовых проектов, которые необходимо распечатать. Кстати перед печатью также сохраняйте файл в PDF, так как принтер может начудить со шрифтами.

Список файлов ответов (шпаргалок)