Диссертация (1335888), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Оценка эффективности ицелесообразности применения фармакогенетического тестирования упациентов, принимающих статиныВ исследование включено 259 пациентов с гиперхолестеринемией и/илиишемической болезнью сердца, проходивших, проходивших лечение в отделенииперсонализированной медицины ГКБ №23 им. И.В. Давыдовского за период 20142015 гг.Критерии включения пациентов в исследование:-Пациенты мужского и женского пола 18 лет и старше;-Наличие показаний к проведению гиполипидемической терапии статинами;Критерии не включения пациентов в исследование:-Наличие противопоказаний к назначению статинов;-Проводимая терапия любым из препаратов группы статинов на моментвключения в исследование или менее, чем за 30 дней до включения в исследование;- Невозможность забора или трудности при заборе крови из кубитальной вены;-Наличие онкологических заболеваний;-Алкоголизм или наркозависимость;-Психические заболевания, недееспособность;-Беременность, период лактации;-Трудности при проглатывании таблеток;Пациентампроводилсязаборвенознойкровидлявыполненияфармакогенетического тестирования – определения полиморфных вариантовSLCO1B1 с целью изучения распространенности полиморфизма SLCO1B1 унаселения города Москвы, а также возможного влияния носительства определенныхполиморфных вариантов гена SLCO1B1 на эффективность и безопасностьпроводимой терапии статинами как на первоначальном этапе, так и с точки зренияотдаленных результатов проводимой терапии.Кроме того, у пациентоврегистрировался исходный уровень следующих показателей биохимического анализакрови: КФК, АЛТ, АСТ, общий холестерин, триглицериды ЛПНП, ЛПВП.
Вдальнейшем с целью оценки отдаленных результатов после выписки из стационара74проводилось анкетирование пациентов по телефону с помощью специальноразработанныханкет-опросников,направленныхнавыявления«мышечных»симптомов, возникших на фоне применения статинов, а также при их наличиивозможной взаимосвязи данных симптомов с проводимой терапией статинами,проводилась оценка динамики биохимических показателей крови (КФК, АЛТ, АСТ,общий холестерин, триглицериды ЛПНП, ЛПВП), общего самочувствия пациентов, атакже оценка соблюдения рекомендованного режима дозирования статинов и оценкиизменения качества жизни после начала терапии статинами. При необходимости ижеланиипациента,пациентыприглашалисьдляочнойконсультацииидообследования.Средний возраст пациентов на момент включение в исследование составил66.6±9.16 лет.
В исследование включено 163 пациента женского пола (62.9%) и 96пациентов мужского пола (37.1%). В таблице 10 представлена нозологическаяхарактеристика пациентов, включенных в исследование.Таблица 10Нозологическая характеристика пациентов, получавших статиныДиагноз.N=259Артериальная гипертония, n (%)255 (98.4%)Ишемическая болезнь сердца, n (%)259 (100%)Сахарный диабет 1 и 2 типа, n (%)71 (27.4%)Нарушение ритма(пароксизмальная и постоянная форма 88 (33.9%)фибрилляции предсердий) , n (%)Ожирение, n (%)135 (52.1%)Стеатоз печени, n (%)131 (50.5%)По представленным в таблице 9 данным видно, что у всех пациентов (259человек), включенных в исследования был установлен диагноз ишемической болезнисердца, при этом у 255 пациентов (98.4%) имелась артериальная гипертония, среди75сопутствующих заболеваний наиболее часто регистрировались ожирение – у 52,1%,стеатозпечени-50.5%,нарушениесердечногоритма(постояннаяилипароксизмальная форма фибрилляции предсердий) – 33.9%, а также сахарный диабет1 и 2 типа – у 27.4%.При обследовании на первоначальном этапе (до начала терапии статинами) у78.7% больных выявлено повышение уровня общего холестерина, у 62.9% больныхтриглицеридов, у 96.5% больных ЛПНП, уровень КФК был в пределах референтныхзначений у всех пациентов, включённых в исследование, незначительное повышениепеченочных трансаминаз выявлено у 7 (2.7%) пациентов, данные изменения порезультатам проведенного дообследования расценены как проявление стеатозапечени и полностью нормализовались перед выпиской из стационара.Проведен анализ с целью оценки наличия возможной взаимосвязи сочетанияисходного уровня общего холестерина и ЛПНП в зависимости от носительстваразличных полиморфных вариантов SLCO1B1, а также оценки эффективностипроводимой терапии статинами у носителей различных полиморфных вариантовSLCO1B1.2.4 Забор кровиДля выполнения биохимического анализа крови, а также определенияаллельных вариантов CYP2C9, генотипа VKORC1 и полиморфных вариантов генаSLCO1B1 у пациентов производился забор венозной крови из кубитальной вены.Объем забора крови у пациентов не превышал 18 мл.
Забор венозной крови длявыполнения биохимического анализа производился в пластиковые пробирки, несодержащие реагента. Для выполнения генотипирования по CYP2C9, VKORC1 иSCLO1B1 забор крови осуществлялся в пробирки с К3-ЭДТА (пробирка с фиолетовойкрышкой). В течении 60 минут от момента забора венозная кровь подвергаласьцентрифугированиювприборесцельюотделениясывороткикрови.Центрифугирование проводилось на центрифуге «Eppendorf», Германия в течении 10минут при температуре +4ºС, скорость всех этапов центрифугирования составляла13400 об.
/минуту. Полученная плазма крови, объемом не менее 1 мл перемещалась вкриопробирки при помощи механического лабораторного дозатора, после чего76проводилась немедленная заморозка при температуре не выше -20 Сº до момента ихполучения лабораторией.2.5 Биохимические методы исследованияБиохимический анализ крови проводился в лаборатории ГКБ №23 им. М.В.Давыдовского.Транспортировкаобразцоввлабораториюпроводиласьвспециальных термических боксах для поддержания необходимой температуры. Всебиохимические показатели определялись с использованием биохимического,автоматического анализатора.Алгоритм работы с пробами в лаборатории:1.
разморозка образцов крови до комнатной температуры;2. помещение образцов крови в биохимический анализатор;3. выбор исследуемых биохимических показателей;4. получение результатов на дисплее автоматического анализатора;5. печать результатов на лабораторных бланках;2.6 Методика определения МНО.Определение показателя МНО проводилось с применением тромбопластинафирмы«Технология-стандарт»(Россия)смеждународныминдексомчувствительности 1,2.2.7 Методика определения CYP2C9 и VKORC1.2.7.1 Выделение геномной ДНК.Проводилось двойное отмывание 100 мкл венозной крови в 500 мкл буфера PBS.После второй отмывки над осадком оставляли 100 мкл супернатанта, в дальнейшемресуспендировали осадок пипетированием, после чего проводилось добавление150 мкл лизирующего буфера и 10 мкл водного раствора протеиназы K (10 мг/мл).Даллее течение 3 часов при температуре проводилась инкубация полученной смеси втечение 3 часов при температуре 65 °С, после чего к ней добавляли 10 мкл 2,5 Мводного раствора NaCl с последующей экстракцией ДНК равными фенолом и смесьюхлороформа и изоамилового спирта в соотношении 24:1, в равном объёме.Выполнялось центрифугирование полученного раствора в течении 10 минут.
Воднаяфаза отбиралась в чистые пробирки, после чего к раствору добавляли равный объём77изопропиловогоспиртасдальнейшимвыполнениемцентрифугированияполученного раствора в течении 30 минут, к осадку проводилось добавление 80%этилового спирта, с последующим центрифугированием в течении 10 минут.Полученный раствор высушивали при температуре 65 °С до полного испаренияэтилового спирта, затем осадок растворяли в 50 мкл буфера ТЕ и подогревали втечении 30 минут при температуре 65 °С, с перемешиванием путем встряхиваниякаждые 10 мин. Хранение полученных образцов ДНК осуществлялось притемпературе -20 °С.2.7.2 Подбор праймеров для выполнения ПЦР для определения полиморфизмаCYP2C9 и VKORC1.Подбор праймеров осуществлялся с помощью компьютерной программы«PrimerSelect 4.05» (DNAStar, Inc) на матрицах базы данных NCBI, содержавшейполные последовательности генов CYP2C9 и VKORC1, включая все экзоны иинтроны.
При подборе праймеров использовали условия, выставленные авторамипрограммы «по умолчанию», из праймеров, предложенных программой, отбиралисьте, которые имели максимальный рейтинг при прочих равных условиях.Последовательностипраймеровдляамплификацииисследованныхлокусовпредставлены в таблице 11.Таблица 11Последовательность праймеров для амплификации исследуемых локусовПолиморфизмArg144CysIle359LeuG-1639(3673)AПоследовательность праймераПрямой5'-GGGGAGGATGGAAAACAGAGACTT-3'Обратный5'-CTTCAAACCCCCGCTTCACA-3'Прямой5'-CAGAAACCGGAGCCCCTGCAT-3'Обратный5'-AGGCTGGTGGGGAGAAGGGCAA-3'Прямой5'-CCAGAAGGGTAGGTGCAACAGTAA-3'Обратный5'-TCACCAAGACGCTAGACCCAATG-3'782.7.3 Амплификация ДНКПЦР выполнялось на амплификаторах моделей «Терцик ТП4-ПЦР01» (ЗАО«НПФ ДНК-Технология», Россия), и «Mastercycler» («Eppendorf AG», Германия,закуплен в ЗАО «Хеликон», Россия). Состав реакционных смесей для выполненияПЦР каждого полиморфизма указаны в таблице 12, программы для амплификации —в таблице 12.Таблица 12Состав реакционной смеси для ПЦР каждого исследуемого полиморфизма (наодну пробирку, мкл)ПолиморфизмыКомпоненты смесиCYP2C9Arg144CysCYP2C9Ile359LeuVKORC1G-1639(3673)AH2O, бидистиллят7,458,4517,4Буфер для Taq-полимеразы1,251,252,5Смесь dNTP, 100 мМ0,50,51211,5Taq-полимераза, 5 ЕД/мкл0,10,10,2Праймеры0,20,20,411212,512,523MgCl2, 25 мМ *ДНКСуммарный объёмТаблица 13Программы для амплификации каждого полиморфизма, °С/секПолиморфизмыХарактеристикаCYP2C9Arg144CysCYP2C9Ile359LeuVKORC1G-1639(3673)AДенатурация геномной ДНК95 / 18095 / 18095 / 180Денатурация95 / 1095 / 1095 / 10Отжиг праймеров70 / 4065 / 4057 / 40Синтез72 / 1572 / 1072 / 12353535Количество циклов, n79Элонгация72 / 4200/00/0Первоначально выполнялась денатурация геномной ДНК при 95 °С в течение3 минут.
Данный процесс выполнялся на протяжении 35 циклов, каждый из которыхсостоял из трёх стадий: денатурации, отжига и синтеза. Первая стадия цикла(денатурация) выполнялась в течение 10 сек при температуре 95 °С. Вторая и третьястадии цикла (отжига и синтеза) выполнялись индивидуально для каждой программы(таблица 13).2.7.4 Расщепление продуктов амплификации рестриктазамиИдентификация аллелей различных полиморфных вариантов генов CYP2C9 иVKORC1 проводилась с помощью обработки продуктов ПЦР соответствующимирестриктазами, указанными таблице 14.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
