Автореферат (1150812), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Диапазон низкой молярной массы полимеров, а такжезначения показателей степенных соотношений, близкие к 0.5, указывают на12отсутствие объемных эффектов. Для оценки длины статистического сегмента идиаметра полимерных цепей используем теории Хирста-Штокмайера и ЯмакаваФуджи, построенные на моделях червеобразного ожерелья или цилиндра безучета эффектов исключенного объема. Для оценки термодинамическойжёсткостиидиаметраполимернойцепииспользовали( = 1.14 ×109 г моль−1 см−1 ) и = 37.8 нм.
Были найдены следующие значения и : = 2.3 ± 0.3 нм, = 0.5 ± 0.2 нм и = 1.5 ± 0.3 нм, = 0.3 ±0.2 нм для данных на основе поступательного ( ) и вращательного трения ( )соответственно.ЗаключительныйкомплексообразованияразделГлавыплазмиднойДНК3посвященизучению( = 2.1 × 106 г моль−1 )илинейного ПЭИ с молярной массой: = 13.4 × 103 г моль−1 . Формированиеи свойства полиэлектролитных комплексов ДНК/ПЭИ были исследованы приразличных соотношениях азото- и фосфоросодержащих групп (соотношениеN/P).Результаты анализа комплексов методом гель-электрофореза показывают,что вся ДНК оказывается связанной с ПЭИ при / ≈ 2. Исследования методомскоростной седиментации показали, что добавление небольшого количестваПЭИ к раствору ДНК (N/P < 1) приводит к увеличению среднего значениякоэффициента седиментации, а также уширению общего распределения.Дальнейшее увеличение концентрации ПЭИ в растворе ДНК (1 ≤ / ≤ 4)приводит к слиянию первоначально сформировавшихся полиплексов иобразованию частиц с гораздо большими размерами.
При содержании ПЭИсоответствующего / > 4, приводит к уменьшению среднего коэффициентаседиментации и стабилизации комплекса в растворе. Асимметрию конечногокомплекса оценивали по установленному значению фрикционного отношения –/ℎ (Рисунок 3 A). Как можно видеть из представленной зависимости,существует явная тенденция уменьшения /ℎ с увеличением отношения /,связанная с образованием более компактных и однородных комплексовДНК/ПЭИ.При относительно низких соотношениях N/P (≤ 1) гидродинамическийразмер объектов уменьшается в результате компактизации молекулы ДНК.13Минимальное значение ≈ 29 нм достигается при / ≈ 0.5. Увеличениеотношения N/P до 1 приводит к небольшому увеличению размера полиплексов,достигающего, примерно, 33 нм.
Образование крупных агрегатов с размерамипорядка1,000 нмпроисходитпри/ ≈ 2.Дальнейшееувеличениеконцентраций ПЭИ в растворе приводит к плавному уменьшению среднихразмеров частиц. При / ≥ 10 полиплексы имеют средний размер около 170 ±60 нм.Рисунок 3. A – Зависимость фрикционного отношения /ℎ от отношенияN/P для комплексов ДНК/ПЭИ.
B – Зависимость гидродинамического размеракомплексов ДНК/ПЭИ от отношения N/P.Морфология полученных комплексов была изучена сканирующей силовоймикроскопией. Полученные результаты хорошо коррелируют с данными изседиментацииигель-электрофореза.Далее,используякомбинациюаналитического и препаративного ультрацентрифугирования, было определеносодержание свободного ПЭИ в растворе, при различных отношениях N/P(6.2, 11.6, 28.6, 57.8).
Определение свободного полиэтиленимина проводилосьпутем анализа надосадочной части раствора, после удаления сформировавшихсякомплексов препаративным центрифугированием. Согласно собранным данным,количество свободного ПЭИ увеличивается с 60.5 % при N/P = 6.2 до 90.5 % приN/P = 57.8. Следует отметить, что согласно полученным данным, фактически,весь ПЭИ связан с ДНК только при N/P ≤ 2.5 (концентрация CPEI (свободный) = 0при N/P ≤ 2.5).14Найденноесоотношениесвязанного/свободногоПЭИ,атакжеколичественные данные о молярных массах комплексов ДНК/ПЭИ позволилиоценить состав комплексов. Так, при N/P = 28.6, полиплексы с размерами 170 нмсостоят в среднем из 180 ДНК-плазмид и 88 молекул ПЭИ, тогда как 320 нмполиплекс при N/P = 6.2 состоит из 3,600 плазмид и 50 молекул ПЭИ.
В то жевремя, при больших N/P наблюдались единичные полиплексы размером 50 ±10 нм, которые состоят из 8 – 33 конденсированных молекул ДНК и 70 – 25молекул ПЭИ. В дополнение к изучению физико-химических свойств, былаисследованаэффективностьтрансфекцииполиплексовприразличныхсоотношениях N/P: адекватные уровни трансфекции достигаются только присоотношениях / ≥ 10, что хорошо согласуется с литературными данными.ЗАКЛЮЧЕНИЕ.В представленной работе были изучены гомологические ряды линейных,катионных полиэлектролитов, содержащих ионогенные группы различногохарактера: первичные, вторичные и третичные амины в основной или боковыхцепях.
Были исследованы интерполиэлектролитные комплексы на основелинейногополиэтиленимина иплазмиднойДНК.Анализ полученныхэкспериментальных результатов позволяет сделать следующие выводы: Проведеныкомплексныеконформационныйанализгидродинамическиедлямакромолекулисследованиякатионныхгомо-иитерполимеров на основе метакрилатов. Определены значения равновеснойжёсткости и диаметра полимерных цепей. Обнаружено и экспериментально исключено влияние некомпенсированныхзарядов на конформационные характеристики макромолекул катионныхгомо- и терполимеров на основе метакрилатов в растворе. Установлено иисследовано влияние α-концевых групп на термодинамику взаимодействийполимер-растворитель. Для линейных полиэтилениминов обнаружено существенное несоответствиемежду номинальной и фактической молярными массами.
Впервые былполучен полный набор скейлинговых соотношений для этих полимеров врастворах и количественно определены конформационные характеристикимакромолекул линейных полиэтилениминов.15 Определена степень связывания ДНК/ПЭИ, а также содержание свободногополиэтиленимина и его влияние на комплексообразование и уровеньтрансфекции комплексов в клетки. На основе проведенного анализа былаполучена количественная информация о структуре и составе комплексов приразличных соотношениях азото- и фосфоросодержащих групп N/P.Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:1. Perevyazko I., Trützschler A.-K., Gubarev A., Lebedeva E., Traeger A., Tsvetkov N.,Schubert U.
S. Absolute characteristics and conformation of cationic polymers byhydrodynamicapproaches:Poly(AEMA-co-MAEMA-co-DMAEMA)statcopolymers. // European Polymer Journal. – 2017. – V. 97. – p. 347-355.2. Perevyazko I., Trützschler A.-K., Gubarev A., Lebedeva E., Traeger A., Schubert U.S., Tsvetkov N. Molecular and structural analysis via hydrodynamic methods: Cationicpoly(2-aminoethyl-methacrylate)s. // Polymer. – 2017. – V. 131. – p. 252-262.3.
Perevyazko I., Gubarev A. S., Tauhardt L., Dobrodumov A., Pavlov G. M., SchubertU. S. Linear poly(ethylene imine)s: true molar masses, solution properties andconformation. // Polymer Chemistry. – 2017. – V. 8. – No. 46. – p. 7169-7179.4. Perevyazko I. Y., Bauer M., Pavlov G. M., Hoeppener S., Schubert S., Fischer D.,Schubert U. S. Polyelectrolyte Complexes of DNA and Linear PEI: Formation,Composition and Properties. // Langmuir.
– 2012. – V. 28. – No. 46. – p. 16167-16176.5. Perevyazko I., Trützschler A-K., Gubarev A., Lebedeva E., Traeger A., SchubertU.S., Tsvetkov N. Molecular and Structural Analysis of Cationic Methacrylates viaHydrodynamic Methods. // In Programme Booklet 23rd International AnalyticalUltracentrifugation Workshop and Symposium, Glasgow, Scotland, United Kingdom,July 23-28, 2017, p. 57.6. Perevyazko I., Trützschler A.-K., Lebedeva E., Schubert U.
S. and Tsvetkov N.Hydrodynamic Analysis of Novel Linear Cationic Polymers for Gene DeliveryApplications. // In Book of abstract IUPAC-PSK40: IUPAC International Symposiumon Advanced Polymeric Materials, Jeju, South Korea, October 4-7, 2016, p.47.7. Перевязко И., Трюшлер А., Губарев А.С., Лебедева Е.В., Шуберт У., ЦветковН.В. Гидродинамический Анализ Инновационных, Катионных Полимеров дляПрименения в Генной Терапии // В Сборнике докладов Научной конференциигрантодержателей РНФ «Фундаментальные химические исследования XXI-говека», Москва, Россия, Ноябрь 20-24, 2016, с.
4918. Perevyazko I., Bauer M., Pavlov G.M., Hoeppener S., Schubert S., Fisher D.,Schubert U.S. Hydrodynamic study of formation and properties of PEI basedpolyplexes. // In Book of abstract 20th International Analytical UltracentrifugationConference, San Antonio, USA, March 25-30, 2012..
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
