Автореферат (1149295), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Рассмотрены алкалоиды различной структуры и их способсвязывания с макромолекулой.В главе 2 изложены теоретические основы используемых в работе методовисследования, а также описание процедур проведения экспериментов. В работебылииспользованыметодыспектрофотометрии,спектрополяриметрии,калориметрии, вискозиметрии и динамического двойного лучепреломления.Эксперименты по калориметрии проводились в ресурсном центре СПбГУ«Термогравиметрические и калориметрические методы исследования».Исследуемые синтетические аналоги алкалоидов были синтезированы вНИИ гигиены, профпатологии и экологии человека ФМБА России.Для приготовления комплексов использовалась высокомолекулярная ДНКфирмы Sigma с молекулярной массой 107 Да. Термодинамические параметрыопределяли с помощью спектрофотометрического титрования и изотермическогокалориметрического титрования.Определение способа связывания лигандов с ДНК проводили с помощьюметодики,разработаннойранеенаосновеметодоввискозиметрииидинамического двойного лучепреломления.
Использование этой методики требуетпроведения концентрационных измерений в условиях сохранения стехиометрии иструктуры обратимых равновесных комплексов лиганда с макромолекулой.8Для определения способа связывания изученных соединений с молекулойДНКбылиполученымолекулярныерастворыихкомплексовзаданнойстехиометрии. Комплексы получали путем прямого смешивания исходныхрастворов ДНК и лигандов, заданной концентрации. Исходные концентрацииреагентов определяли на основе данных спектрофотометрического титрования(СФТ).
Их допустимые значения были определены в процессе исследованиягидродинамического поведения растворов комплексов ДНК с ранее изученнымипроизводными актиноцина (рис.1) в зависимости от концентраций исходныхрастворов.Рис. 1. Структурапроизводныхактиноцина.Было обнаружено, что в случае использования для приготовления растворовкомплексов с содержанием лиганда 1-5 молекул на 100 пар азотистых основанийДНК (r˂0.05) концентрации ДНК (Сисх.), при которой происходит перекрываниемакромолекулярных клубков (Сисх.=8·10-3%), разбавление исходных раствороввызывает аномальное увеличение вязкости (рис.2).Рис. 2. Зависимость (ηr-1)/СДНК от СДНК40при3комплексов при r=0.01 при Сисх.=4·10-3% (2);35301253r-1)/CДНК,м /кгμ=0.001 для свободной ДНК (1) и ее20241510500,00,51,01,52,02,53,0-3CДНК,10 %3,54,04,55,0при Сисх.=8·10-3%: ДНК-сод.1, ДНК-соед.2 (3),ДНК-соед.3, ДНК-соед.4, ДНК-соед.5 (4).9Такоеповедениерастворовможетбытьвызванообразованиеммежмолекулярных сшивок при связывании лиганда с ДНК.
Возникновениесшивок наблюдается при ионной силе раствора 0.001М и характерно только длясоединений, имеющих в амидных группах протонированную диэтиламиногруппировку (соед. 1 и 2, рис.1). С увеличением ионной силы до 0.1 М никакиханомальных эффектов не наблюдалось. В отсутствии межмолекулярных сшивокстольмалоесодержаниегидродинамическихлигандапараметрахвозникновениесшивокгидрофобнымивзаимодействиямивкомплексераствора.обусловленокакбоковыхМожнонесказываетсяпредположить,электростатическими,групплигандасоначтотакислучайносблизившимися участками цепи, принадлежащими разным молекулам ДНК.Полученные результаты далее учитывались при приготовлении комплексовновых синтетических алкалоидов с ДНК. Используемые условия приготовлениякомплексов исключали образование межмолекулярных сшивок.В главе 3 рассматривается взаимодействие производнных изохинолина(рис.3) с молекулой ДНК.
Изохинолиновое ядро входит в структуру многихприродных алкалоидов, таких как папаверин, морфин, кодеин.Рис. 3. Структура производныхизохинолина: а – индольныепроизводные изохинолина, б –пирроло-изохинолины.Изменения в спектрах поглощения (рис.4а) в присутствии ДНК, а такжетепловые эффекты, наблюдаемые при изотермическом калориметрическом10титровании (ИКТ) (рис.4б), свидетельствуют о наличии взаимодействия иобразовании комплексов производных изохинолина с ДНК.Наличие изобестической точки на кривых СФТ соединений 6, 9, 10 (рис.4а),а также монотонное изменение количества теплоты, выделяющееся в процессеИКТ (рис.4б), свидетельствуют о наличии только одного типа связывания. Длясоединений 7, 8, 11 оба метода демонстрируют появление второго типасвязывания при увеличении содержания лиганда в комплексе.
На это указываетобразование второй изобестической точки (рис.5а) и характер зависимостиколичества теплоты от соотношения концентраций лиганда и ДНК (рис.5б).Вторичный способ связывания носит димерный или агрегационный характер.Термодинамическиепараметрысвязыванияэтихсоединенийопределялиметодами ИКТ для моделей идентичных независимых мест связывания и двухнезависимых типов связывания.0,40аСДНКРис.4.
(а) – СФТбсоед.9, (б) – ИКТ20,350Q/кол-во в-ва, ккал/моль0,30D0,250,20СДНК0,150,100,05соед.9.-2-4-6-8-100,003003203403603800,04000,10,2аС ДНК0,350,300,25D0,40,50,6б0Q/кол-во в-ва, ккал/моль0,400,3C лиг/C ДНКнм0,20СДНК0,150,10-2Рис.5. (а) – СФТ-4соед.8, (б) – ИКТ-6соед.8.-80,05-100,00340360380400420нм4404604800,00 ,51,01,52,0C лиг/C ДНКДля определения структуры образовавшихся комплексов измеряли иххарактеристическую вязкость, [η], и соотношение11 n g 0 ,(1)характеризующее оптическую анизотропию статистического сегментамакромолекулы А, где Δn – разность двух главных показателей преломления, g –градиент скорости, η0 – вязкость растворителя, η – вязкость раствора. Наосновании модели свободно-сочлененной цепи, в предположении постоянстваобъемных эффектов вычисляли изменение контурной длины L макромолекулыпри образовании комплекса.Для всех комплексов ДНК с производными изохинолина величинасоотношения 1 остается постоянной в пределах погрешности, что говорит оботсутствии изменений термодинамической жесткости макромолекулы приобразовании комплекса.
Следовательно, рост [η] может происходить только засчет увеличения контурной длины L.Основным признаком интеркаляциихромофора лиганда в двойную спираль ДНК является увеличение контурнойдлины макромолекулы, согласно соотношению Lr = L0(l+r). Соответствующееизменение этого параметра наблюдается только при связывании ДНК синдольными производными изохинолина 6 и 8. В случае соединения 7 измененияконтурной длины макромолекулы не происходит. Следовательно, первые двасоединения интеркалируют в двойную спираль ДНК, а соединение 7 связывается сДНК неинтеркаляционным способом. Можно предположить, что интеркаляцияиндольных производных изохинолина происходит за счет индольного ядра, накотором отсутствует метильная группа.
Вторичное связывание в виде димероввозникает благодаря взаимодействию изохинолиновых хромофоров молекуллиганда при отсутствии на них метильной группы.Увеличение контурной длины макромолекулы при ее взаимодействии спирроло-изохинолинами (соед. 9-11) меньше ожидаемого при классическом12интеркаляционном связывании. Можно сделать вывод о связывании этихсоединений по модели неполной или частичной интеркаляции.Вглаве4рассмотреновзаимодействиесДНКпроизводныхбензоимидазофталазина, различающихся по структуре заместителей вдольдлинной и короткой оси хромофора (рис.6).Все соединения хорошо растворяются в спирте и ограниченно в воде, что непозволяет использовать для определения термодинамических параметров методИКТ. Для этих целей использовали метод СФТ. Кривые СФТ этих соединенийможно разделить на три группы.NR1NNR2Рис. 6.
Структурапроизводныхбензоимидазофталазина.КривыеСФТпервойгруппыимеютизобестическуюточку,свидетельствующую об одном типе связывания. Такой вид имеют кривые СФТпроизводныхбензоимидазофталазина,имеющихвположении1остатокпиперазина (соед. 21-23) или морфолина (соед.17).Кривые СФТ второй группы, к которым относятся кривые СФТ всехсоединений с пиперидиновым заместителем в 1-ом положении хромофора, неимеют изобестической точки. Взаимодействие с ДНК приводит к значительномууменьшению интенсивности в длинноволновой полосе поглощения соединенийбез заметного сдвига.13У соединений третьей группы в присутствии ДНК не наблюдается заметныхизменений в спектре поглощения, что свидетельствует об отсутствии связываниялиганда с макромолекулой в данных условиях.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
