Диссертация (1149183), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Фосфатные группы ДНК и липидовизображены сферами.62Рис. 16. Параметр порядка для ФХ липидов, которые связаны с ДНК ионамикальция, несвязанных с ДНК, и всех липидов в монослое, находящимся в контакте сДНК. Показаны результаты для цепи sn-1; усреднение было проведено попромежутку времени от 465 до 485 нс, в течение которого количество мостиковоставалось постоянным.63Рис.
17. Профиль плотности для участвующих в кальциевом мостике (связанных) ине участвующих (несвязанных) фосфатных и холиновых липидов, а также ионовкальция. Значение расстояния = 0 соответствует центру масс липидной мембраны.Сильное электростатическое связывание ДНК с липидной мембраной в присутствии кальция также влияет на структуру и свойства ДНК [49, 54]. Было обнаружено, что средне-квадратичное смещение структуры ДНК от начальной канонической В-формы уменьшается после адсорбции.
Флуктуации средне-квадратичногосмещения также уменьшаются, так что ионы кальция снижают подвижность ДНК наповерхности мембраны (Рис. 18). Этот эффект может объяснить увеличение температуры плавления ДНК при образовании комплекса с липидами в присутствии каль-64ция [40]: для плавления ДНК необходимо дополнительно разрушить кальциевые мостики между фосфатными группами липидов и ДНК.Рис . 18. Среднеквадратичное отклонение додекамера ДНК от начальной В-формыдля системы 6 (Таблица 2).Дополнительно,былопроведеномоделированиесистемы“Сa2+-ДНК-мембрана” с 100 ммоль соли NaCl (система 4, Таблица 2), которое показало, что общая картина адсорбции остаётся такой же, как для систем без соли NaCl. В основномэто обусловлено тем, что моновалентные ионы Na+ не способны конкурировать сионами кальция за места связывания с липидными молекулами (Рис.
12).65Таким образом, из всего вышесказанного следуют важные выводы. Компьютерное моделирование с использованием атомистических моделей позволило детально изучить кинетику адсорбции ДНК на цвиттерионную фосфатидилхолиновуюмембрану в присутствии ионов кальция, а также структуру и стабильность образовавшегося комплекса. В конечном итоге исследования показывают, что ионы кальцияиграют двойную роль в ДНК-фосфолипидных системах. Во-первых, связываниедвухвалентных катионов с поверхностью липидной мембраны делает её положительно заряженной, вызывая электростатическое притяжение полианионной ДНК.Во-вторых, результаты работы показывают, что ионы кальция играют ключевую рольдля стабилизации ДНК-липидного комплекса, так как они соединяют фосфатныегруппы ДНК и липидных молекул.
В отличие от существовавших на данный моментгипотез, результаты исследования показывают, что взаимодействия между холиновыми группами фосфолипидов и фосфатов ДНК играют незначительную роль, таккак они нестабильны и характеризуются короткими временами жизни: времена жизни для таких взаимодействий на два порядка меньше времен жизни для кальциевыхмостиков, соединяющих фосфатные группы ДНК и липидов.4.4. Связывание ДНК с бислоем с пред-адсорбированными ионами кальцияДля изучения адсорбции ДНК на липидный бислой с заранее адсорбированными иона кальция, было также проведено моделирование без приложения внешнейсилы к ДНК. Компьютерное моделирование было проведено для больших систем посравнению с системами для изучения ПСЭ.
Каждая система состояла из двойногододекамера ДНК (24 пары оснований), 46 ионов Na+ (в качестве контрионов ДНК),молекул воды (количество варьировалось от 15 000 до 25 000) и липидного бислоя из288 молекул ПОФХ с заранее адсорбированными ионами кальция (системы 5-8, Таблица 1).
Для систем 5 и 6 с отношением липид/кальций = 13,1 были использованыконечные конфигурации липидного бислоя с ионами кальция системы 2, а для си-66стем 7 и 8 (с отношением липид/кальций равным 6,4) конечные конфигурации системы 3. Молекула ДНК была расположена параллельно поверхности бислоя,начальное расстояние между ДНК и липидным бислоем было 0,5 или 1.0 нм (системы с буквами А и Б в названии, соответственно, Таблица 1). Время моделированиячетырех ДНК-липидных систем с пред-адсорбированным кальцием на бислой варьировалось от 600 до 1200 нс, общее время моделирования всех систем составило 3,8микросекунды. Во всех случаях обнаружена очень быстрая адсорбция молекулыДНК на поверхность бислоя. На Рисунке 19 изображено расстояние между центрамимасс ДНК и липидного бислоя вдоль нормали к поверхности бислоя как функциявремени в течение первых 100 нс моделирования.Рис. 19. Расстояние между центрами масс ДНК и липидным бислоем вдоль направления, перпендикулярного поверхности бислоя как функция времени.
Показаны результаты для систем 5-8,соответственно, Таблица 1.67Из графика видно, что адсорбция ДНК происходит в первые 20 нс. Согласнопрофилю энергии, рассмотренному ранее (Рис. 8), это подтверждает сильное притяжение между ДНК и липидным бислоем с пред-асорбированными ионами кальция.Для описания кинетики адсорбции была рассчитана временная зависимость образования контактов между холиновыми группами липидов и фосфатными группамиДНК и кальциевые мостики, соединяющие фосфатные группы ДНК и липидов.
Рисунок 20 показывает количество этих типов контактов в зависимости от времени длясистемы 6. При адсорбции ДНК на липидный бислой фосфатные группы ДНК сначала контактируют с холиновыми группами липидов, так как холиновые группы(Nфх) ближе расположены к водной фазе по сравнению с фосфатными группами. Всвязи с этим, в начале моделирования наблюдается резкое увеличение количестваконтактов Nфх-Pднк. В свою очередь, кальциевые мостики Pфх–Ca–Pднк могут образоваться только когда ДНК внедряется в бислой за счет электростатического притяжения, и ион кальция, связанный с фосфатной группой липида, находится вблизифосфатной группы ДНК.
Как видно из Рисунка 20, в первые 120 нс кальциевые мостики отсутствуют. Они начинают появляться на более поздних стадиях за счет латеральной диффузии ионов кальция по направлению к молекуле ДНК. Рисунок 20(б) показывает постепенное увеличение числа ионов кальция, участвующих в мостиках Pфх–Ca–Pднк: c течением времени всё больше и больше ионов приближается кмолекуле ДНК, адсорбированной на поверхности бислоя.
В связи с этим многоступенчатое образование Pфх–Ca–Pднк контактов является достаточно медленным процессом, требующим 800-1000 нс.68а)б)Рис. 20. (а) Количество различных ДНК-липидных контактов как функция времени (система 6). Показаны контакты между холиновыми группами липидов и фосфатными группами ДНК и кальциевые мостики, соединяющие фосфатные группыДНК и липидов. (б) Количество ионов Ca2+, участвующих в мостиках Pфх–Ca–Pднк как функция времени.69На Рисунке 21 показано образование мостиков Pфх–Ca–Pднк в результате латеральной диффузии ионов кальция (система 6). Мгновенные конфигурации системынаглядно демонстрируют, что ионы кальция, которые в начале моделирования находятся далеко от ДНК, в итоге дифундируют к макромолекуле и образуют мостикимежду фосфатными группами ДНК и липидных молекул (заметим, что при образовании мостиков ионы кальция скрываются под молекулой ДНК и становятся невидимыми при рассмотрении сверху (Рис.
21, г)). Одним из последствий образованиямостиков является то, что молекула ДНК снижает подвижность некоторых липидов.Ранее Викторовым и др. при помощи 31P-ЯМР метода при использовании тионовогоаналога фосфатидилхолина было показано, что взаимодействие фосфолипидов сДНК приводит к иммобилизации фосфатных групп молекул липидов [54].
Для оценки влияния ДНК на динамику липидных молекул в данной работе был рассчитан коэффициент латеральной диффузии липидов согласно методике, описанной в главе 2.Для липидного бислоя ПОФХ (система 1, таблица 1) DL = 6.8 ± 0.6 * 10-8 см2 / с. Экспериментальное значение DL для липидного бислоя ПОФХ при температуре 300 Кравно 7.8 * 10-8 см2 / с [122]. При добавлении ионов кальция к бислою (система 2,Таблица 1) коэффициент латеральной диффузии снижается до 5.5 ± 0.7 * 10 -8 см2 / с,что согласуется со значением ранее проведенного компьютерного моделирования[121].
Данное снижение обусловлено тем, что липиды являются частями кальцийлипидных агрегатов и не могут двигаться независимо от других липидов. Для оценки DL в присутствии ДНК были определены липидные молекулы, находящиеся непосредственно под молекулой ДНК. Так как латеральное смещение липидов на временном масштабе 100 нс относительно мало (не более 0,5 нм), для расчетов использовался фиксированный набор липидов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
