Автореферат (1149182), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Наиболееэнергетически выгодное положение ДНК в липидно-водной фазе совпадает с положениемотрицательно заряженных фосфатных групп ДНК, которые находятся в контакте садсорбированными на липидную поверхность ионами кальция.11Чтобы изучить кинетику образования ДНК-липидного комплекса в присутствии ионовкальция, была проведена серия компьютерных моделирований, в которых ДНКрасполагалась в непосредственной близости от поверхности ПОФХ липидной мембраны.Сначала были исследованы системы, в которых ионы были добавлены одновременно сДНК. В этом случае в начале компьютерного эксперимента липидная мембрана не имеетположительного заряда на поверхности, а отрицательно заряженная ДНК окруженадвухвалентными ионами кальция.Стандартная система “ДНК-липидная мембрана” состояла из фрагмента ДНК(двойной додекамер Дрю-Диккерсона из 24 пар оснований с общим зарядом -46е), 46контрионов Na+ , липидного бислоя, состоящего из 288 молекул липидов ПОФХ и ~ 25 000молекул воды.
Каждая система имела 45 Ca2+ ионов и 90 Cl- ионов, что соответствовалоконцентрации соли ~ 100 ммоль CaCl2 (концентрация была рассчитана относительнообщего количества молекул воды). Общее количество атомов в системе составляло ~115 000. На рисунке 4 показано типичное изменение расстояния между центрами массмолекулы ДНК и фосфолипидной мембраной вдоль вектора нормали мембраны с течениемвремени.Рис. 4.Временнаярасстояниямеждузависимостьцентрамимассфрагмента ДНК и фосфолипидноймембраны вдоль вектора нормали кповерхностимембраны.Показанырезультаты для систем с различнымначальнымцентрамимембранойрасстояниеммассДНК(0,18,0,5имеждулипиднойи1нм,соответственно).Из рисунка 4 видно, что присутствие ионов кальция в растворе приводит к резкомууменьшению расстояния между липидной мембраной и ДНК.
Это свидетельствует обадсорбции ДНК на липидный бислой в присутствии двухвалентных ионов. В результатеэтой адсорбции можно обнаружить образование стабильного ДНК-липидного комплекса.Согласно гипотезе, высказанной ранее, существует две моды связывания ДНК с ФХлипидами в присутствии ионов кальция: 1) холиновые группы липидов связываются сфосфатными группами ДНК и 2) фосфатные группы ДНК и липидов связываются припомощи ионов кальция. Для определения роли этих двух типов связывания было12рассчитано количество различных контактов между ДНК, липидами и ионами кальция.Данная характеристика изображена на рисунке 5. Прежде всего видно, что на начальныхэтапах адсорбции ДНК связывание ионов Са2+ с фосфатными группами ФХ липидовоказывается самым быстрым процессом.
Это связывание начинается сразу же после началамоделирования и делает поверхность мембраны положительно заряженной: монослоймембраны из 144 липидов приобретает положительный заряд +30е (15 адсорбированныхионов Ca2+ ) в течение 50 нс (Рис. 5).Рис. 5. Количество контактов междуфосфатнымигруппамихолиновымигруппамиДНКилипидов(серый), количество мостиков междуфосфатами ДНК и липида (черный) иколичество контактов ионов кальция сфосфатнымигруппамилипидов(черный пунктир) в зависимости отвремени.Что касается формирования кальциевых мостиков между фосфатами ДНК и липидов, то ихформирование начинается с задержкой ~10-15 нс по отношению к образованию контактовPднк-Nфх. Скорее всего, это связано с тем, что средний угол между PN вектором ивектором нормали к поверхности мембраны равен 69,3 ± 1,4 градусов, так что холиновыегруппы расположены ближе к водной фазе и более доступны для ДНК во время еёадсорбции.
В целом, процесс адсорбции ДНК на цвиттерионную мембрану происходитсравнительно быстро: после добавления Са2+ ионов, количество контактов Pднк-Nфхдостигает своего равновесного значения в течение первых 100 нс. В противоположностьэтому, количество кальциевых мостиков продолжает увеличиваться в течение 100-150 нс,это указывает на существование медленной структурной перестройки в образующемсяДНК-липидном комплексе.
Было показано, что эти структурные изменения связаны сосложным многоступенчатым образованием агрегатов ионов кальция и фосфатных групплипидов и ДНК (Рис. 6). Сначала образуется Са-мостик между фосфатом ДНК и фосфатомодного липида, позднее же в течение нескольких сотен наносекунд большинство агрегатовуже включают один фосфат ДНК и фосфатные группы трех липидов. Среднее количестволипидов, входящих в Ca-связанный агрегат равняется 2.88 ± 0.02.До настоящего времени одним из нерешенных вопросов являлся относительныйвклад двух типов ДНК-липидных взаимодействий в стабильность комплекса.
Чтобы13исследовать вклад каждого взаимодействия, были рассчитаны времена жизни для обоихтипов контактов. Было обнаружено, что время жизни связанных кальциевых мостиковсоставляет 98 ± 14 нс, а время жизни контактов холиновых групп липидов с ДНК равно 3,2± 1,5 нс (усреднение проводилось по последним 200 нс траекторий, когда адсорбция ДНКуже закончилась (рисунок 4)).Рис. 6. Количество агрегатов Pфх-Ca-Pднк различного типа как функция времени.Таким образом, расчеты свидетельствуют о том, что связанные мостики Pфх-Pднкявляются доминирующим фактором в стабилизации комплекса “ДНК-мембрана”, так каких время жизни почти на 2 порядка больше, чем соответствующее время контактовхолиновых групп липидов и ДНК.Было обнаружено, что время жизни некоторых Са-мостиков составляет болееполовины микросекунды, что близко к общему времени моделирования. Кроме того,кальциевые мостики способствуют увеличению времени жизни контактов холиновых групплипидов и ДНК. Детальный анализ самых стабильных контактов Nфх-Pднк показал, чтобольшинство стабильных контактов существует благодаря совокупности двух факторов:наличию кальциевого мостика и сильной адсорбции ДНК на липидную мембрану, чтоприводит к иммобилизации липидов, находящихся в контакте с ДНК.14Чтобы оценить влияние кальциевых мостиков на стабильность контактов холиновыхгрупп липидов и ДНК, было рассчитано время жизни Nфх-Pднк контактов в началемоделирования (первые 100 нс), когда влияние кальциевых мостиков минимально.Действительно, в этом случае было обнаружено, что время жизни контактов холиновыхгрупп липидов и ДНК падает до 0,66 ± 0.07 нс (т.е.
в 5 раз), что подтверждает влияниекальциевых мостиков на более поздних стадиях адсорбции ДНК. Более того, это приводит кдругому важному выводу: нестабильные и короткоживущие взаимодействия междухолиновыми группами липидов и фосфатными группами ДНК не имеют большого влиянияна комплексообразование ДНК с цвиттерионной липидной мембраной.Кроме того, взаимодействие фосфатных групп липидов и ДНК оказалось настолькосильным, что оно привело к локальному изменению структурных свойств мембраны.
Былообнаружено, что неполярные углеводородные цепи липидов, связанных при помощикальция с ДНК, более разупорядочены по сравнению с остальными липидами: параметрпорядка для ненасыщенной цепи sn-1 липидов, связанных с кальцием, меньше, чем длянесвязанных липидов. Такое разупорядочивание липидных цепей может быть объясненозначительным “вдавливанием” фрагмента ДНК в фазу липид-вода, которое выталкиваетДНК-связанные липиды по направлению к центру мембраны. Исследование профиляплотности фосфолипидов показывает, что фосфатные группы, участвующие в кальциевыхмостиках находятся ближе к центру мембраны приблизительно на 0.35 нм, поэтомухарактеризуются большим свободным объемом, что и приводит к разупорядочиванию.Сильное электростатическое связывание ДНК с липидной мембраной в присутствиикальция также влияет на структуру и свойства ДНК.
Было обнаружено, что флуктуациисредне-квадратичного смещения от начальной канонической формы ДНК уменьшаются втаком комплексе, так что ионы кальция уменьшают подвижность ДНК на поверхностимембраны.Также была изучена самопроизвольная адсорбция ДНК на липидный бислой садсорбированными ионами кальция. В этом случае ионы кальция, которые в началемоделирования находились на липидном бислое вдали от ДНК, адсорбированной наповерхность, в итоге приближались к макромолекуле ДНК и образовывали стабильныемостики между фосфатными группами ДНК и липидных молекул. Одним из последствийобразования мостиков является тот факт, что молекула ДНК понижает подвижностьнекоторых липидов. Для оценки влияния адсорбции ДНК на динамику липидных молекулбыл рассчитан коэффициент латеральной диффузии липидов.
Для липидного бислоя DLравняется 6.8 ± 0.6 * 10-8 см2 / с. При добавлении ионов кальция к бислою коэффициентлатеральной диффузии уменьшается до 5.5 ± 0.7 * 10-8 см2 / с. Данное снижение15обусловлено тем, что липиды включены в кальций-липидные агрегаты и не могут двигатьсянезависимо. Для оценки DL в присутствии ДНК были определены липидные молекулы,находящиеся непосредственно под молекулой ДНК. Коэффициент латеральной диффузииэтих липидов равняется 3.8 ± 1 * 10-8 см2 / с. Таким образом, адсорбция молекулы ДНК наповерхность бислоя значительно уменьшает латеральную диффузию липидных молекул,приводя к иммобилизации липидов.В заключении сформулированы важные выводы по всей диссертационной работе.Выводы1.
Методами компьютерного моделирования исследован профиль свободной энергии,динамические и структурные характеристики ДНК-липидного комплекса и установленмолекулярный механизм образования ДНК-липидного комплекса.2. Показано,чтоцвиттерионныйфосфолипидныйбислойпредставляетсобойэнергетический барьер для молекулы ДНК. Отсутствие локального минимума впрофиле свободной энергии свидетельствует об отсутствии притяжения между ДНК илипидным бислоем.3.
Установлено, что адсорбированные на поверхность бислоя ионы кальция приводят кпоявлению минимума в профиле свободной энергии при перемещении ДНК вглубьбислоя. Этот минимум соответствует электростатическому притяжению молекулы ДНКи липидного бислоя. Адсорбция ДНК на липидный бислой сопровождаетсяобразованием кальциевых мостиков между фосфатными группами ДНК и липидныхмолекул и формированием контактов холиновых групп липидов и ДНК.4. Показано, что кальциевые мостики между фосфатными группами ДНК и липидныхмолекул являются доминирующим фактором в стабилизации комплекса ДНК-мембрана,так как их времена жизни почти на 2 порядка больше, чем соответствующие временадля контактов холиновых групп липидов и ДНК.5. Исследование структурных и динамических свойств комплекса показало, что адсорбциямолекулы ДНК на липидный бислой снижает латеральную диффузию находящихся вконтакте с ней липидов и приводит к разупорядочиванию этих липидов.Список цитируемой литературы:1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
