Автореферат (1149182), страница 2
Текст из файла (страница 2)
8th international symposium “Molecular order and mobility in polymer systems”, СанктПетербург, 20142.IX International conference of young scientists on chemistry „Mendeleev-2015”, СанктПетербург, 20153. 11-th International Conference on Diffusion in Solids and Liquids-DSL 2015, Мюнхен,Германия, 20154. 3rd European Joint Theoretical/Experimental Meeting on Membranes, Стокгольм, Швеция,20155. 11th International Saint-Petersburg Conference of Young Scientists “Modern problems ofpolymer science”, Санкт-Петербург, 20156.International Student Conference “Science and Progress”, Санкт-Петербург, 2015(отмечено дипломом за лучший устный доклад)Структура работыДиссертационная работа изложена на 84 страницах и состоит из введения, четырёх глав,заключения и списка литературы, который включает 124 наименования. Диссертациясодержит 21 рисунок и 2 таблицы.Содержание работыВ первой главе представлен обзор литературы.
В этой главе представлена информация оневирусных методах доставки ДНК в клетку, в частности, о генных векторах на основекатионныхлипосом.Приведенырезультатыэкспериментальныхисследованийцвиттерионных липидов и молекул ДНК, взаимодействия их с ионами. Кроме того, описаносовременное состояние методов компьютерного моделирования.7Вторая глава посвящена описанию условий моделирования и созданию рассматриваемыхсистем; приведены сведения об используемых методах и моделях, а также подходах дляанализа траекторий моделирования.Для проведения исследований взаимодействия молекулы ДНК с липидным бислоем,состоящим из молекул фосфатидилхолина, использован метод молекулярной динамики,реализованный в программном пакете Gromacs 4.5 [1]. Для описания молекул ДНК ифосфатидилхолина в водном растворе использовались реалистичные атомистическиемодели, которые в явном виде учитывают химическую структуру компонентов системы(ДНК, липиды, молекулы воды, ионы).
В работе использован наиболее изученныйфрагмент ДНК — двунитевой додекамер Дрю-Диккерсона d[CGCGAATTCGCG]2 [2]. Дляописания потенциала взаимодействия молекулы ДНК использовалась современная версияAmber99parmbsc0 с модификацией углов [3]. Так как потенциалы взаимодействия всехсоставляющихсистемыдолжныбытьсовместимы,длямолекулыпальметоилолеоилфосфатидилхолина (ПОФХ) применяется новейшее силовое полеAmberLipid14 для липидов [4].
По этой же причине в системе используется модель водыTIP3P. Для описания моновалентных и двухвалентных ионов были использованыстандартные параметры силового поля Amber99.Для моделирования были использованы широко распространенные и проверенныеметоды и подходы. Cистемы моделировались в изотермо-изобарическом ансамблеансамбле при температуре 303 K и давлении 1 Бар.
Температура поддерживалась припомощи модифицированного термостата Берендсена с дополнительной стохастическойпоправкой к кинетической энергии, обеспечивающей ее правильное распределение(velocity-resсaling). Давление контролировалось при помощи анизотропного баростатаБерендсена. Взаимодействия Леннарда-Джонса обрезались на расстоянии 1 нм, дляэлектростатических взаимодействий был применен современный particle-mesh Ewald(PME).
Шаг по времени составлял 2 фс. Для расчета профиля свободной энергии в работеиспользовался метод зонтичной выборки, основанный на приложении гармоническогопотенциала между центрами масс ДНК и бислоя вдоль координаты Z. Для этого додекамерДНК был помещен параллельно поверхности бислоя (перпендикулярно оси Z).
Начальноерасстояние между центрами масс липидного бислоя и ДНК было равно 4,8 нм. На центрмасс ДНК действовала сила, направленная к центру масс липидного бислоя вдолькоординаты Z (силовая константа k = 1000 кДж·моль-1·нм-2). В результате такогомоделирования было получено 35 конфигураций системы на расстоянии 0.1 нм друг отдруга (таким образом, расстояние между центрами масс варьировалось от 4,8 нм до 1,4 нм сшагом 0,1 нм вдоль оси Z).
Каждая конфигурация служила начальной для независимых8моделирований методом зонтичной выборки в течение 100 нс (силовая константа k = 3000кДж·моль-1·нм-2), первые 20 нс из которых рассматривались как уравновешивание системыи не использовались для анализа. Профиль свободной энергии вдоль оси Z был вычисленпри помощи метода анализа взвешенных гистограмм (Weighted Histogram Analysis Method,WHAM), имплементированного в пакет Gromacs.Что касается анализа полученных траекторий, одной из важных характеристикявлялось количество контактов (ненормированное координационное число).
В началерассчитывалась радиальная функция распределения для пары атомов. Были рассмотреныследующие пары: Nфх (атомы азота холиновых групп ФХ) − Pднк (атомы фосфатов ДНК),Ca − Pфх (атомы фосфатов ФХ головных групп), Ca – Pднк, Na − Pфх, и Na − Pднк. Далеебыли определены положения первых минимумов радиальной функции распределения; этиминимумы соответствовали радиусу первой координационной сферы. Были полученыследующие радиусы: 0.45 нм для пар Ca − Pфх и Ca − Pднк, 0.42 нм для пар Na − Pфх и Na− Pднк, и 0.6 нм для пары Nфх − Pднк. Количество контактов между атомами A и Bрассчитывалось по количеству атомов B в первой координационной сфере атома A.Считалось, что ионы адсорбировали на мембрану, когда они попадали в первуюкоординационную сферу атома Pфх липида.
Кроме того, считалось, что “Ca-мостик” (“Naмостик”) между фосфатными группами ДНК и липидных молекул образуется, когда обаатома Pфх и Pднк находятся внутри координационной сферы одного и того же иона Ca2+(Na+).Анализ динамических и структурных характеристик липидного бислоя включал в себярасчет таких величин как площадь, приходящаяся на один липид, ориентация вектора,соединяющего атомы Pфх и Nфх (PN вектор) по отношению к вектору нормали кповерхности мембраны, параметр порядка, коэффициент латеральной диффузии.Для изучения подвижности липидов использовался коэффициент латеральной диффузииDL, который был рассчитан согласно следующей формуле1[r (t )]2t →∞ 4tDL = limгде[r (t )]2 – среднеквадратичное смещение, t – время.В данной работе последние 100 нс моделирования были разбиты на 10 частей.
Дляувеличения точности коэффициент диффузии был измерен отдельно для каждого 10-нсучастка траектории. Конечное значение коэффициента диффузии липидов было полученоусреднением коэффициентов каждого участка на всей 100-нс траектории.9В третьей главе приведены результаты исследования системы “ДНК-липидный бислой” вводном растворе.Первым шагом при изучении взаимодействий молекулы ДНК с липидным бислоембыло компьютерное моделирование системы в водном растворе, не содержащемдвухвалентных ионов, в котором фрагмент ДНК помещен параллельно поверхности бислоя,состоящего из липидных молекул ПОФХ.
Стандартная система ДНК-мембрана состояла измолекулы ДНК (двойной додекамер Диккерсона (24 пары оснований с общим зарядом 46e), 46 противоионов натрия Na+ , липидной мембраны, состоящей из 288 молекул ПОФХ,и ~ 25 000 молекул воды. Время моделирования систем составляло 100-150 нс. Этоговремени было достаточно, чтобы сделать вывод об адсорбции ДНК. На рисунке 1 показанорасстояние между молекулой ДНК и липидным бислоем для трех систем, в которыхначальное расстояние между центрами масс ДНК и липидной мембраной было равно 0,18,0,5 и 1 нм. Согласно рисунку 1 ДНК не имеет тенденции к адсорбции и не взаимодействуетс липидным бислоем во всех исследуемых системах.Рис 1.расстоянияВременнаямеждузависимостьцентрамимассфрагмента ДНК и фосфолипидноймембраны вдоль вектора нормали кповерхности мембраны.Для более убедительного доказательства отсутствия притяжения между ДНК и липиднымбислоем был рассчитан профиль свободной энергии.
С этой целью был применен методзонтичной выборки, описанный в предыдущей главе. С целью уменьшения временирасчетов была рассмотрена система, состоявшая из додекамера ДНК (12 пар оснований),расположенного параллельно липидному бислою, состоящему из 128 липидов. На рисунке2 представлен профиль свободной энергии в зависимости от расстояния между центрамимасс ДНК и бислоя.10Рис 2.
Профиль свободной энергии приперемещенииводногомолекулыокружениялипидногокбислоя.ДНКизповерхностиВертикальнаяпунктирная линия показывает среднееположение фосфатных групп липидов.Отсутствиекакого-либолокальногоминимумавпрофилесвободнойэнергиисвидетельствует об отсутствии притяжения между ДНК и липидным бислоем. Другимисловами, цвиттерионный фосфолипидный бислой представляет собой энергетическийбарьер для молекулы ДНК.Четвертая глава посвящена исследованию механизма образования ДНК-липидногокомплекса в присутствии ионов кальция.С целью изучения влияния ионов кальция на взаимодействия между молекулой ДНК ицвиттерионным липидным бислоем был исследован профиль свободной энергии длядодекамера ДНК и бислоя с пред-адсорбированными ионами кальция (20 ионов Са2+ на 128липидов), рисунок 3.Рис. 3.
Профиль свободной энергиипри перемещении молекулы ДНК изводногоокружениякповерхностилипидного бислоя с адсорбированными ионами кальция. Вертикальнаяпунктирная линия показывает среднееположение фосфатных групп липидов.Согласно результатам исследования можно сделать вывод о том, что адсорбированные наповерхность бислоя ионы кальция приводят к появлению минимума в профиле свободнойэнергии (то есть области с отрицательными энергиями). Этот минимум соответствуетэлектростатическому притяжению между молекулой ДНК и липидным бислоем.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
