Диссертация (1145906), страница 18
Текст из файла (страница 18)
Более того, только Sup35NM-M5pотличается по интенсивности накопления агрегатов по сравнению с контролем(Рис. 38). Исходя из перечисленных данных и предположений, мы считаем, чтоSup35-M4p формирует фибриллы, которые с большей скоростью присоединяютбелок, поскольку агрегаты Sup35NM-M4p значительно превосходят по длинеконтрольный вариант (Sup35NMp) (Рис. 41). Альтернативным объяснениемнаблюдаемого феномена могла бы быть повышенная эффективность агрегациимутантного белка.
Эта гипотеза плохо согласуются с данными in vivo, согласнокоторым усиление [PSI+] в присутствии sup35-M4 сохраняется и после заменымутации на SUP35 (Рис. 15). Вероятно, эта мутация приводит именно кформированиюагрегатов,которыеэффективнееприсоединяютксебемономерный белок.Мутации sup35-M3, sup35-M4 и sup35-M5 локализуются за пределамиучастка, необходимого для поддержания супер-складчатой β-структуры, однакооказывают влияние на свойства приона и, вероятно, приводят к возникновениюновых вариантов [PSI+]. В экспериментах in vitro нам удалось зафиксироватьразличия в структуре фибрилл, образованных мутантными белками Sup35NM,от агрегатов белка дикого типа: все они были шире (Рис. 40).
В ряде работ такжебыли обнаружены отличия в структурной организации агрегатов Sup35p разныхвариантов [PSI+] (Toyama et al., 2007; Chang et al., 2008). Рассматриваемые100мутации sup35KK изменяют укладку белковых молекул в составе агрегатов Sup35p,но не дестабилизируют структуру в целом (Рис. 42).7.3. Влияние комбинаций мутаций sup35KK на стабильность приона [PSI+]Мутации sup35-M4 — sup35-M5 приводят к изменению конформации Sup35pв составе агрегатов и к появлению новых вариантов [PSI+], а эффекты мутацийзависят от варианта приона (Рис.
34). В этой связи исследование стабильность[PSI+] при сочетании sup35KK позволило сделать предположения о конкретныхизменениях супер-складчатой β-структуры.Мутация sup35-M2 при комбинации с любой из других аллелей sup35KKприводит к дестабилизации приона (Рис. 30, Табл. 7). Это позволяет подтвердитьранее высказанное нами предположение, что мутации sup35-M3, sup35-M4 иsup35-M5 лежат за пределами региона, необходимого для поддержания суперскладчатой β-структуры, и не приводят к изменению его границ. С другойстороны, доминантно-негативный эффект sup35-M2, связанный с дестабилизациейприона при сочетании с sup35-M3, sup35-M4 и sup35-M5, подтверждаетсущественную роль второго повтора (56-64 а.к.) для поддержания [PSI+](Osherovich et al., 2004; Shkundina et al., 2006).
Сконструированные нами мутацииsup35KK,согласнотеоретическимпредпосылкам,оказываютвлияниенастабильность приона [PSI+] только если они находятся в регионе, образующемсупер-складчатую β-структуру. Мутации sup35-M1, sup35-M2, а также sup35-M4оказывают влияние на стабильность приона [PSI+] сами по себе, или в сочетании сдругими аллелями sup35KK. Таким образом, мы предполагаем, что в прионныхагрегатах белка дикого типа, характерных для исследованного варианта приона,соответствующие повторы участвуют в образовании супер-складчатой βструктуры. При этом только первые два олигопептидных повтора входят в составрегиона,необходимогодляподдержаниясупер-складчатойβ-структуры,поскольку только sup35-M1 и sup35-M2 сами по себе приводят к потере [PSI+].Четвертый повтор может участвовать в формировании β-структуры, но неявляется необходимым для ее поддержания, поскольку мутация sup35-M4 сама по101себе не приводит к потере фактора [PSI+] и дестабилизирует прион только всочетании с другими аллелями.
Также необходимо уточнить, что в данном случаемы говорим о конформации белка дикого типа, характерной для исходноговарианта [PSI+], до изменения его свойств под влиянием аллелей sup35KK (Рис. 43).Мутация sup35-M3 не имеет каких-либо эффектов, даже при сочетании с другимиаллелями sup35KK. Поэтому, следуя той же логике, мы предполагаем, что третийповтор не вовлечен в формирование супер-складчатой β-структуры. Возможно,этот участок «выпетливается» сбоку от фибриллы (Рис. 43). Это уточнениехорошо объясняет отсутствие эффектов этой мутации.Рисунок 43. Возможные схемы организации β-слоев в исследованных прионных агрегатах.На рисунке представлена предполагаемая организация β-слоев Sup35p дикого типа в исходномварианте [PSI+] и после изменений под влиянием аллелей sup35KK. OR – олигопептидныеповторы N-домена Sup35p.
Стрелками обозначены повторы, предположительно формирующиеβ-слои.Внесение аллели sup35-M4 в штаммы [PSI+] с sup35-M3 или sup35-M5приводит к дестабилизации приона (Рис. 30, Табл. 7). Эта же мутация усиливаетприон, поддерживающийся в присутствии SUP35 дикого типа. Согласнолитературным данным, сильные варианты приона [PSI+] характеризуются менеепротяженной β-структурой (Toyama et al., 2007; Chang et al., 2008).
Совокупностьэтих фактов позволяет нам предположить, что четвертый повтор мутантного белка102Sup35-M4 не может участвовать в образовании β-структуры (Рис. 43). Это влечетзасобойукорочениефрагментабелка,вовлеченноговформированиесупер-складчатой β-структуры, и усиление приона. Данное предположениехорошо согласуется с отсутствием эффектов sup35-M3 при ее введении в клетки,содержащие sup35-M4, а также с гипотезой о том, что sup35-M4 ведет кобразованию нового варианта приона [PSI+]. Совмещение же мутантного белкаSup35-M4 с белками, несущими замены в соседних олигопептидных повторах(при введении sup35-M4 в клетки, содержащие sup35-M3 или sup35-M5) приводитк дестабилизации всей структуры.Во всех случаях дестабилизация приона при сочетании различных мутацийsup35KK совпадает с увеличением размера гетероагрегатов мутантных белков(Рис. 31).
Кроме того, внесение аллели sup35-M4 в исследуемые штаммы [PSI+]приводит к увеличению температурной стабильности агрегатов Sup35p (Рис. 32).Эти факты позволяют предположить, что в исследованных случаях потеря прионасвязанасизменениемэффективностифрагментацииагрегатовSup35pшаперонами. Аналогичный эффект был показан для мутаций PNM (DiSalvo et al.,2011). Ранее была высказана гипотеза, согласно которой олигонуклеотидныеповторы N-домена Sup35p опосредуют взаимодействие этого белка с шаперонами,от которых зависит стабильность приона (Shkundina et al., 2006). Нельзяисключить, что исследуемые нами мутации нарушают пока неописанные сайтысвязывания Sup35p с шаперонами, локализованные в этом участке.
Различия вэффектах sup35-M2 и sup35-M4 (и отсутствие влияния sup35-M2 на стабильностьгетероагрегатов)могутбытьобъясненыразличнойлокализациейсоответствующих мутаций.7.4. ЗаключениеВ ходе работы мы описали влияние аллелей sup35KK на свойства [PSI+] ивыявиликонкретныемолекулярныемеханизмы,лежащиевосновесоответствующих эффектов.
В зависимости от своего положения мутацииприводят либо к потере приона, либо к формированию его новых вариантов.103Аминокислотные замены в Sup35-M3p по нашим данным локализованы запределамирегиона,участвующеговформированиисупер-складчатойβ-структуры, поэтому соответствующая аллель лишь незнчительно влияет насвойства [PSI+]. Белок Sup35-M1 не может образовывать гомоагрегаты на основеисследованного варианта приона, и в этом случае [PSI+] сохраняется толькоблагодаря присутствию аллели SUP35 дикого типа. Включение белка Sup35-M2 вагрегаты Sup35p приводит к изменению их структуры, что в большинстве случаевприводит к образованию ненаследуемых амилоидов и потере приона.
Аллелиsup35-M1 и sup35-M2 располагаются в пределах региона, необходимого дляподдержания супер-складчатой β-структуры, поэтому они и приводят кисчезновению [PSI+]. Мутации в четвертом и пятом олигопептидных повторахприводят к появлению новых вариантов приона. [PSI+], сохраняющийся вприсутствии sup35-M4, имеет более короткий участок белка, участвующий вобразовании β-структуры, поэтому эффективнее присоединяет мономеры Sup35p.Вариант[PSI+],образованныйSup35-M5p,характеризуетсясниженнымколичеством пропагонов и поэтому более слабым нонсенс-супрессорнымфенотипом. Вероятно, Hsp104p хуже фрагментирует соответствующие белковыеагрегаты.1048. ВЫВОДЫ1.Мутации, которые расположены в пределах фрагмента белка, вовлеченногов формирование супер-складчатой β-структуры (sup35-M1 и sup35-M2),приводят к потере фактора [PSI+].
Мутации sup35-M4 и sup35-M5 приводятк формированию новых вариантов приона.2.Первый, второй и четвертый олигопептидные повторы N-домена Sup35pучаствуют в образовании супер-складчатой β-структуры.3.Эффекты мутаций sup35KK зависят от варианта приона [PSI+] и не зависят от[PIN+]-статуса клетки.4.Все исследованные мутации sup35KK влияют на структуру агрегатов Sup35pin vitro.1059.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ1.Амен Т.Р., Михайлова Е.В., Аленин В.В., Артемов А.В., Дементьев П.А., ХодорковскийМ.А., Артамонова Т.О., Кузнецова И.М., Сойдла Т.Р., Невзглядова О.В. Сравнительнаяструктурная и функциональная характериастика разных форм красного пигмента дрожжейSaccharomyces cerevisiae и его синтетического аналога // Цитология. 2012. Т. 54. № 11.
С. 853–861.2.Невзглядова О.В., Артемов А.В., Миттенберг А.Г., Михайлова Е.В., Кузнецова И.М.,Туроверов К.К., Сойдла Т.Р. Влияние красного пигмента на амилоидизацию белков удрожжей // Цитология. 2010. Т. 52. № 1. С. 80–93.3.Шкундина И.С., Тер-Аванесян М.Д. Прионы // Успехи биологической химии. 2006. Т. 46.С. 3–42.4.Afanasieva E.G., Kushnirov V. V, Tuite M.F., Ter-Avanesyan M.D.
Molecular basis fortransmission barrier and interference between closely related prion proteins in yeast // J. Biol. Chem.2011. Т. 286. № 18. С. 15773–80.5.Alberio T., Lopiano L., Fasano M. Cellular models to investigate biochemical pathways inParkinson’s disease // FEBS J. 2012. Т.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
