Диссертация (1145906), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Иными словами, Sup35-M1p может коагрегировать с Sup35p дикого типа,94но не с таким же мутантным белком Sup35-M1 (Рис. 42).Мутация sup35-M2 не может поддерживать исследованный вариант [PSI+](Рис. 15,17) и приводит к дестабилизации приона даже в гетерозиготномсостоянии (Рис. 11). Аналогичными свойствами обладает PNM2 (Doel et al., 1994),эта мутация приводит к исчезновению приона из-за изменения дезагрегазнойактивности шаперона Hsp104p по отношению к гетероагрегатам белка дикого типаи мутантного (DiSalvo et al., 2011).
Потеря приона при сочетании sup35-M2 иSUP35 неполная и составляет порядка 70%, а эффективность этого процессазависит от количества клеточных делений (Рис. 21). Это не связано с ослаблением[PSI+], поскольку сохранившиеся варианты приона не отличаются по силенонсенс-супрессорного фенотипа и митотической стабильности от исходногоштамма (Рис. 22,23). Вероятно, только часть прион-формирующего участкаSup35-M2p может связываться с агрегатами белка дикого типа и изменятьсупер-складчатую β-структуру. Следующая молекула, которая присоединится ктакомугетероагрегату,копируетэтоизменение.Свидетельстватакихмодификаций удалось выявить при сравнении размеров агрегатов среди клеток[PSI+], которые потеряли плазмиду с sup35-M2 (Рис.
23). Вероятно, в большинствеслучаев это приводит к формированию ненаследуемых амилоидов, что и приводитк исчезновению приона. Аналогичный механизм был ранее предложен дляобъяснения механизмов межвидового барьера при передачи [PSI+] (Afanasieva etal., 2011).Другим объяснением потери приона в присутствии Sup35-M2p может бытьблокирование роста фибрилл (обозначаемое также «growth poisoning») приприсоединении мутантного белка (Chen et al., 2007; Chen et al., 2010; Afanasieva etal., 2011).
Этот механизм подразумевает значительное увеличение долимономерного Sup35p, однако мы этого не наблюдали (Рис. 19).95Рисунок 42. Влияние мутаций sup35KK на свойства приона [PSI+].Еще одним потенциальным механизмом, объясняющим потерю приона присочетании sup35-M2 и SUP35, могло бы быть изменение дезагрегазной активностиHsp104p по отношению к гетероагрегатам двух белков. Этот шаперон необходимдля поддержания [PSI+] в клетках дрожжей, его отсутствие или сверхпродукцияприводят к исчезновению приона (Chernoff et al., 1995). Описанная выше гипотезабыла доказана для мутаций PNM (DiSalvo et al., 2011). Если бы Hsp104p не могразрезать агрегаты Sup35-M2p, то, вероятно, динамика потери приона присочетании sup35-M2 и SUP35 походила бы на изгнание приона под действием ГГХ(Ferreira et al., 2001) и была бы полной.
Согласно полученными нами данным, вэтом случае [PSI+] исчезает только в 70% случаев (Рис. 21). В связи с этим мысчитаем это предположение менее вероятным, однако не можем полностьюисключить его. Таким образом, мы склоняемся к нашей исходной гипотезе,согласно которой присоединение Sup35-M2p к агрегатам Sup35p вызывает96изменение конформации супер-складчатой β-структуры.
В большинстве случаевэто приводит к формированию ненаследуемых амилоидов и, как следствие, кпотере [PSI+].В системе in vitro, белки Sup35NM-M1 и Sup35NM-M2 образуют болеекороткие фибриллы по сравнению с контрольным вариантом (Рис. 41). Наличиеагрегатов свидетельствует о том, что описанные эффекты этих мутаций несвязаны с общей неспособностью белка поддерживать прион. В тоже время, этибелки, в отличие от остальных исследованных вариантов Sup35NM, с меньшейэффективностью образуют фибриллы, что подтверждает важность региона с1-го по 64-ый а.к. для поддержания [PSI+] (Osherovich et al., 2004).7.2.
Влияние мутаций sup35-M3, sup35-M4 и sup35-M5 на свойства приона[PSI+]Мутации sup35-M3, sup35-M4 и sup35-M5 не приводят к потере [PSI+](Рис. 14, 15, 17).Этопозволяетпредположить,чтосоответствующиеаминокислотные замены расположены за пределами региона, необходимого дляподдержания супер-складчатой β-структуры. Тем не менее, в их присутствиисвойства [PSI+] изменяются. Как уже было отмечено, [PSI+] передается со 100%эффективностью при замене SUP35 на одну из рассматриваемых мутаций(sup35-M3, sup35-M4 и sup35-M5) (Рис. 17). При обратной смене аллелей(с sup35KK на SUP35) прион, сохранявшийся в присутствии sup35-M5, теряется(Рис. 15). Для [PSI+] аналогичное явление было описано ранее и получилоназвание «асимметрия межвидового барьера» (Chen et al., 2007; Chen et al., 2010).Мутацииsup35-M4 и sup35-M5 меняют нонсенс-супрессорный фенотип,вызванный прионом [PSI+].
Штамм [PSI+], несущий sup35-M4, лучше растет насреде без аденина по сравнению с диким типом, а штамм с sup35-M5, наоборот —хуже (Рис. 15). Различия в уровне нонсенс-супрессии в присутствии sup35-M4такжеподтверждаютсяприиспользованииспециализированныхметодовколичественной оценки, в частности, измерения активности β-галактозидазы(Рис. 29).
Варианты приона также могут отличаться по эффективности97нонсенс-супрессии (Derkatch et al., 1996), поэтому мы предположили, что эти двемутации приводят к формированию новых вариантов [PSI+]. В этой связи важноотметить, что наблюдаемые различия в нонсенс-супрессорном фенотипе несвязаны ни с собственным фенотипическим проявлением мутаций (Рис. 13), ни сизменением количества Sup35p в клетках с sup35KK (Рис.
16). Кроме этого,усиление приона в присутствии sup35-M4 сохраняется даже после заменымутации на SUP35 (Рис. 15, 29).Кроме отличий в эффективности нонсенс-супрессии варианты [PSI+] могутотличаться друг от друга по целому ряду признаков: например, по митотическойстабильности (Derkatch et al., 1996), размеру агрегатов (Kryndushkin et al., 2003) иих термостабильности (Tanaka et al., 2004), а также количеству пропагонов (Cox etal., 2003; Tanaka et al., 2006).
В ходе нашей работы мы сравнили варианты [PSI+],сохраняющиеся в присутствии sup35KK, по перечисленным критериям. Они неотличаются по митотической стабильности (Рис. 24), и, следовательно, измененияв их фенотипе не связаны с этой характеристикой. Все остальные из упомянутыхпараметров так или иначе изменяются под действием мутаций sup35-M3 —sup35-M5.Мутации sup35-M4 и sup35-M5 приводят к изменению размаха вариацииразмеров агрегатов Sup35p. В случае sup35-M4 эта модификация оказываетсянеобратимой, поскольку сохраняется даже после замены мутации на SUP35дикого типа (Рис. 25). В штаммах [PSI+] с этими мутациями немного уменьшаетсяколичество мелких агрегатов Sup35p (нижняя граница агрегатов сдвигаетсявыше).
Более крупные агрегаты Sup35p в большинстве случаев характерны дляболее слабых вариантов [PSI+] с низкой эффективностью нонсенс-супрессии(Kryndushkin et al., 2003). Эту особенность связывают с тем, что Hsp104p хужеразбирает такие комплексы. В результате уменьшается количество агрегатов вклетке и, как следствие, число точек полимеризации белка. Это влечет за собойувеличениедолимономерногоSup35pиснижениеэффективностинонсенс-супрессии (Kushnirov et al., 1998; Kryndushkin et al., 2003).
Такое98объяснение хорошо подходит для [PSI+], сохранившегося в присутствии sup35-M5,поскольку соотвествующий штамм дрожжей хуже растет на среде без аденина(Рис. 15). В случае sup35-M4 фенотипическое проявление приона усиливается, носредний размер агрегатов Sup35p лишь незначительно меняется. Такой феноменможет быть объяснен повышением скорости агрегации мономерного Sup35p, чтоприводит к уменьшению мономерного Sup35p и усилению нонсенс-супрессии(Kushnirov et al., 1998; Kryndushkin et al., 2003).Агрегаты Sup35-M3p, Sup35-M4p и Sup35-M5p характеризуются повышеннойтермостабильностью по сравнению с агрегатами белка дикого типа (Рис.
27). Этотфакт позволяет предположить, что все мутации, в том числе sup35-M3, оказываютвлияние на стабильность агрегатов Sup35p. Замены полярных незаряженныхаминокислот на заряженные должны уменьшать количество межмолекулярныхводородных связей в образующихся амилоидах. Теоретически это должноприводить к снижению стабильности агрегатов мутантных белков, однако нашинаблюдениясвидетельствуютобобратном.Вероятно,термостабильностьагрегатов связана с комплексом факторов, часть из которых пока остаетсянеизвестной. Нельзя исключить, что в основе наблюдаемого феномена лежитмодификация свойств белка Sup35.
Тем не менее, в рамках проделанной работыфактов, которые бы могли свидетельствовать в пользу этого предположения, небыло обнаружено. Скорее наоборот, мутации sup35KK не имеют собственногононсенс-супрессорного фенотипа (Рис. 13), а также не влияют на количествобелка Sup35 в клетке (Рис.
16).Количество пропагонов во многом определяет эффективность агрегацииSup35p в клетке [PSI+]. Чем больше пропагонов, тем лучше идет этот процесс.В результате это отражается и на уровне нонсенс-супрессии (Kryndushkin et al.,2003; Tanaka et al., 2006). Среди исследованных нами вариантов [PSI+] количествопропагонов уменьшено только в клетках с мутацией sup35-M5 (Рис. 29). Этот фактподтверждает наше предположение о том, что Hsp104 хуже разрезает агрегатыSup35-M5p. Таким образом, новые пропагоны образуются реже, а имеющиеся99агрегаты увеличиваются в размерах.
Важно также отметить, что в присутствииsup35-M4 количество пропагонов не отличается от штамма с аллелью дикого типа(Рис. 29). Это согласуется с нашей гипотезой, согласно которой увеличениеразмера агрегатов Sup35-M4p не связано с изменением сродства Hsp104p к ним,а вызвано повышением скорости агрегации Sup35p.По длине фибрилл, образованных in vitro, также удалось косвенно оценитьскорость агрегации мутантных белков, поскольку в этой системе этот процессничем не ограничивается. Теоретически протяженность агрегатов зависит толькоот скорости присоединения новых молекул белка и, в меньшей степени, отинтенсивности формирования новых затравок.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
