Диссертация (1145906), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Всочетании с другими данным это позволило нам сделать вывод, что эти мутацииприводят к потере приона [PSI+].Рисунок 18. Мутации sup35-M1 и sup35-M2 приводят к потере агрегатов Sup35p. На верхнейчасти рисункапредставлены результаты эксперимента с SDD-AGE, на нижней —модифицированного SDS-PAGE. В обоих случаях использовали лизаты клеток, несущих толькомутации sup35KK. * отмечен не специфичный сигнал, который присутствует во всех пробах.
Длядетекции белков использовали поликлональные антитела к eRF3.696.2.6. Белки Sup35-M1 и Sup35-M2 включаются в состав прионныхагрегатов [PSI+]Согласно полученным нами данным, мутации sup35-M1 и sup35-M2 приводятк потере приона в отсутствии аллели дикого типа, при этом только sup35-M2демонстрируетаналогичныйэффектвприсутствииSUP35.Однимизпредположений, объясняющих эти результаты, было то, что белок Sup35-M1 неможет включаться в прионные агрегаты. Для проверки этой гипотезы получилиштамм [PSI+], в котором прион поддерживался на фоне химерной конструкцииSUP35,слитойсфрагментом,кодирующемгемагглютинин(SUP35-HA)(Afanasieva et al., 2011).
Этот штамм трансформировали плазмидами pRSU1,несущими мутации sup35-M1 и sup35-M2. Из-за различий мутантных белков ибелка дикого типа, слитого с гемагглютинином, по молекулярной массе, их можноотличать по электрофоретической подвижности. С помощью модифицированногоSDS-PAGE с кипячением геля (Kushnirov et al., 2006) проверили наличиемутантных белков в агрегированной фракции (Рис. 19). Клеточную массу длявыделения белков получали в селективных условиях, чтобы обеспечитьподдержаниеобеихплазмид.Результатыэтогоэкспериментапродемонстрировали, что оба мутантных белка способны коагрегировать с белкомдикого типа в штамме [PSI+].
Этот факт позволил отвергнуть гипотезу онеспособности Sup35-M1p включаться в состав предсуществующих агрегатов.Рисунок 19. Мутантные белки Sup35-M1 и Sup35-M2 могут входить в состав агрегатовSup35p. Белки из лизатов трансформантов [PSI+], содержащих SUP35-HA дикого типа совместнос sup35-M1 — sup35-M2, были разделены с помощью модифицированного SDS-PAGE скипячением геля. Для детекции белков использовали поликлональные антитела к eRF3.706.2.7. Мутации sup35-M1 и sup35-M2 могут индуцировать возникновениеприона [PSI+] de novoОдним из возможных объяснений потери приона [PSI+] в присутствииsup35-M1 или sup35-M2 могла быть неспособность соответствующих белковподдерживать прион.
Мы проверили возможность индукции фактора [PSI+]de novo за счет сверхэкспрессии этих аллелей. Для этого эксперимента былисконструированы плазмиды, в которых мутации sup35-M1 и sup35-M2 находятсяпод контролем индуцибельного галактозного промотора. Этими плазмидамитрансформировали штамм [psi-][PIN+], несущий аллель SUP35 дикого типа. Вкачестве положительно контроля мы использовали плазмиду с геном дикого типа,вкачествеотрицательного—пустойвекторpRS316.Мыотобралипо 16 трансформантов и трижды с интервалом в два дня пересеяли их на среде сгалактозой и рафинозой, а затем проверили их нонсенс-супрессорный фенотип насреде с глюкозой.
Наличие в среде глюкозы блокирует экспрессию генов,находящихся под контролем галактозного промотора. Все трансформанты,несущие плазмиды для индукции приона, приобрели способность расти на средебез аденина (Рис. 20). Таким образом, мы подтвердили, что исследуемые мутациимогут индуцировать появление приона, а потеря фактора [PSI+] в присутствиимутаций sup35-M1 и sup35-M2 не связана с неспособностью этих аллелейподдерживать прион.Рисунок 20. Мутаций sup35-M1 и sup35-M2 могут индуцировать возникновение приона[PSI+] de novo. Представлены фенотипы трансформантов штамма [psi-], несущих плазмиды длясверхэкспрессии мутаций sup35-M1 и sup35-M2.
Клетки трижды были пересеяны на среде сгалактозой перед переносом на среду без аденина.716.2.8. Дестабилизация [PSI+] в присутствии sup35-M2 зависит отколичества клеточных деленийДля более детального исследования молекулярных механизмов элиминацииприона под действием sup35-M1 и sup35-M2 мы проследили динамику потери[PSI+] во времени. Для этого штамм [PSI+], несущий ген SUP35 на лейциновойплазмиде, был трансформирован плазмидами pRSU2 (URA3) с мутантнымиаллелями.
Трансформационную смесь засевали непосредственно в жидкую средубез урацила и лейцина. Каждая трансформация осуществлялась в трехповторностях. Полученные культуры в дальнейшем регулярно разводили свежейсредой для поддержания логарифмической стадии роста культуры. Два раза всутки из этих культур отбирали аликвоты и высевали их на среду с 5-ФОК, накоторой селектировали клетки, недавно потерявшие урациловую плазмиду смутацией. Среди отобранных колоний оценивали процент клеток [PSI+] по окраскена среде MD 1/5 Ade.
На этой среде, как и на 1/4 YEPD, присутствие прионаможно оценивать по цвету колоний. В рамках эксперимента белые, розовые исекторные колонии учитывались как [PSI+]. Количество клеточных поколенийрассчитывали, исходя из данных об оптической плотности культур. В контрольномэксперименте клетки инкубировали в присутствии 4 мМ ГГХ. В этих условиях,согласно литературным данным, прион [PSI+] теряется (Tuite et al., 1981), аэффективность этого процесса зависит от количества клеточных делений(Eaglestone et al., 2000). Согласно полученным нами данным, только sup35-M2приводит к потере приона в присутствии аллели дикого типа (Рис. 21).
Этохорошо согласуется с данными, полученными нами ранее. Интересно отметить,что интенсивная потеря [PSI+] в клетках SUP35/sup35-M2 наблюдалась толькопервые 20 делений. В ходе последующих поколений доля клеток с приономстабилизировалось на уровне примерно 30 %, и такое соотношение сохранялосьвплоть до 50 поколения. На среде с ГГХ по истечении 15 поколений не оставалоськлеток Ade+. В отличие от sup35-M2, присутствие мутации sup35-M1 не приводилок значимой дестабилизации приона (Рис. 21).72Рисунок 21.
Дестабилизация [PSI+] в присутствии sup35-M2 зависит от количестваклеточных делений. Представлена зависимость доли клеток с прионом от количестваклеточных делений в присутствии мутаций sup35-M1 (М1) или sup35-M2 (М2), а также4 мМ ГГХ (GuHCl).Однимизвозможныхобъясненийнеобычногоэффектаsup35-M2,проявляющегося в дестабилизации [PSI+], могло быть ослабление приона, вчастности, снижение его митотической стабильности. Для проверки этогопредположения на среде с 5-ФОК изолировали семь штаммов, которые более 50поколений несли мутацию sup35-M2 вместе с аллелью дикого типа. Затем этиштаммы субклонировали на среде 1/4 YEPD. Красные колонии не былизафиксировали ни в одном из случаев появления. Это позволило опровергнутьгипотезу о возможном снижении митотической стабильности приона (Рис. 22).Рисунок 22.
Варианты [PSI+], сохранившиеся в присутствии sup35-M2 в гетерозиготномсостоянии, не отличаются по митотической стабильности. Представлен фенотип штаммовна среде 1/4 YEPD. [PSI+]WT - вариант приона, до внесения в клетки sup35-M2. Цифрами от 1 до7 отмечены варианты приона, возникшие при сочетании мутации sup35-M2 и аллели дикоготипа.73Мы также сравнили нонсенс-супрессорный фенотип и размер агрегатовSup35p у этих штаммов. Исследуемые варианты [PSI+] не отличались поспособности расти на среде без аденина, однако демонстрировали небольшиеотличия по размеру агрегатов Sup35p (Рис. 23).
На основании полученных данныхбыло сделано предположение, что белок Sup35-M2, агрегируя с Sup35p, изменяетструктуру фибрилл. Это в большинстве случаев приводит к потере приона; востальныхслучаяхизмененнаяконформацияоказываетсяспособнойподдерживать [PSI+] в дальнейших поколениях.Рисунок 23. Варианты [PSI+], сохранившиеся в присутствии sup35-M2 в гетерозиготномсостоянии, отличаются по размеру агрегатов Sup35p. На рисунке представлены результатыSDD-AGE лизатов штаммов, содержащих мутацию sup35-M2, в течение более чем50 клеточных делений.
Белок тироглобулин был использован в качестве высокомолекулярногомаркера. В нижней части рисунка представлен нонсенс-супрессорный фенотип этих жештаммов, высеянных на среду без аденина в серии пятикратных разведений.6.2.9. Мутации sup35-M3, sup35-M4 и sup35-M5 не влияют намитотическую стабильность приона [PSI+]Согласно нашим данным, мутации sup35-M4 и sup35-M5 изменяютфенотипическое проявление приона и влияют на способность [PSI+] передаватьсяна аллель дикого типа (Рис. 15). На основании этих данных мы предположили, чтомутации sup35KK могут приводить к формированию новых вариантов приона.Одной из ключевых характеристик, по которой штаммы [PSI+] отличаются друг отдруга, является их митотическая стабильность.
Для количественной оценки этогопараметра штаммы [PSI+], несущие различные мутации sup35KK, субклонировали.Затем несколько колоний рассеяли на среде MD 1/5 Ade, а среди получившихся74клонов оценили процент Ade+. Согласно полученным данным, варианты [PSI+],сохранившиеся в присутствии мутаций sup35KK, не отличаются по митотическойстабильности (Рис. 24).Рисунок 24. Мутации sup35-M3, sup35-M4 и sup35-M5 не влияют на митотическуюстабильность приона [PSI+]. На гистограмме отложены значения процента клеток Ade+ исоответствующие ошибки.6.2.10. Мутации sup35-M4 и sup35-M5 приводят к изменению размераагрегатов Sup35pРазмер агрегатов Sup35p является важной характеристикой вариантов [PSI+].Более крупные агрегаты свойственны для слабых вариантов [PSI+] (Kryndushkin etal., 2003).
Это может быть связано как с различной эффективностьюфрагментации агрегатов шаперонами (Kushnirov et al., 1998), так и со скоростьюприсоединения мономеров к агрегату (Kryndushkin et al., 2003; Tanaka et al., 2006).Продолжая поиск отличий между [PSI+], сохранившимися в присутствии sup35KK,мы сравнили размер агрегатов Sup35p в штаммах, несущих мутантные аллелиSUP35, и их производных с аллелью дикого типа (фенотипы штаммовпредставлены на рисунке 15). По нашим данным, агрегаты Sup35-M4p иSup35-M5p меньше варьируют по размеру по сравнению с другими аллелямиSUP35. Более того, отличия по этому параметру сохраняются даже после заменыsup35-M4 на SUP35 (Рис. 25). Из-за потери приона [PSI+] при смене плазмиды сsup35-M5 на конструкцию с SUP35 мы не смогли детектировать агрегаты Sup35p всоответствующих штаммах.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
