Автореферат (1145771), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Растворы в сосудах постоянно аэрировали и обновляли каждые7 суток. Величину рН растворов поддерживали на уровне 5,8±0,1, в отдельныхопытах - на уровне 4,5±0,2 или 6,8±0,2. Растения выращивали в световой установкепри освещенности на уровне верхнего листа 250 мкмоль фотонов ·м -2 ·сек-1 ,световой режим: 16 ч свет (24oC±1°C)/ 8 ч темнота (18oC±1°C), относительнаявлажность 70-75%.6Опыты по воздействию Cd и Zn проводили на растениях 6-недельноговозраста, продолжительность воздействия- 7 суток. Cd вносили в растворы в форме3CdSO48H2O в концентрациях 0 (контроль), 30 и 90 мкМ, Zn - в формеZnSO4·7H2O в концентрациях 0, 100 и 300 мкМ. Все опыты выполняли в 3-кратнойповторности.
По окончании опыта растения разделяли на корни, стебли, зрелыелистья нижнего яруса и молодые (ювенильные) листья верхнего яруса. Корни втечение 5 мин отмывали последовательно в 0,1 мМ растворе CaCl2 и вдистиллированной воде. В отдельной серии опытов корни разделяли на кончиккорня, среднюю часть и основание корня. Сырую биомассу органов оценивалитрадиционно гравиметрическим методом. Растительный материал фиксировалипри 105°С в течение 1 часа и высушивали при 70°С в течение 24 часов доабсолютно сухого веса.Для определения содержания Cd, Zn, а также K, Ca и Mg сухой материализмельчали, отобранные пробы озоляли смесью концентрированных HNO3 :HClO4в объемном отношении 4:1 при 160oC. Анализы выполняли в Образовательном РЦпо направлению химия СПбГУ. Содержание Cd и Zn определяли на атомноабсорбционном спектрометре AA-7000 (“SHIMADZU”, Япония).
Содержание K,Ca и Mg -на оптическом эмиссионном спектрометре с индуктивно-связаннойплазмойICPE-9000(“SHIMADZU”,Япония).Содержаниеводоикислоторастворимой форм оксалата определяли в сухом материале путемэкстракции водой или 1N HCl (1:100) и титрования оксалатов в кислой среде сиспользованием метода перманганатометрии согласно (Осмоловская и др., 2007).Локализацию Cd в органах растений определялис использованиемгистохимического метода (Серегин и др., 2004).
Исследование окрашенных срезовпроводили с помощью светового микроскопа Leica DM 4500p ( Германия) в РЦ"Хромас" СПбГУ. Локализацию Zn в органах амаранта определяли насканирующем электронном микроскопе - микроанализаторе TM3000 (Hitachi,Япония) с использованием программы SwiftED300. Обнаружение кристалловоксалата Cd, Zn и Ca вофракции из листьев амаранта выполняли намикроанализаторе TM3000 в РЦ микроскопии и микроанализа СПбГУ. Анализфазового состава кристаллов оксалата Cd и Ca в органах амаранта проводилирентгенодифракционным методом в РЦ «Рентгенодифракционные методыисследования» СПбГУ на дифрактометре Bruker «D2 Phaser».Анализ состава и определение концентраций метаболитов проводили всухом материале с использованием метода газовой хромато-масс-спектрометрии(ГХ-МС).
Подготовка проб для анализа включала получение метанольныхэкстрактов, их высушивание, растворение в пиридине, силилирование и анализтриметилсилильных производных с помощью газового хроматографа Agilent6850GC с масс-селективным детектором 5975С (США) и на газовом хромато массспектрометре GCMS-QP2010 Plus фирмы SHIMADZU по методике, описанной(Пожванов и др., 2017). Сбор данных осуществляли с помощью программногообеспечения Agilent ChemStation. Обработка и интерпретация данных проводиласьс использованием программы AMDIS и стандартных библиотек масс-спектровNIST2005 и Wiley6. Количественная интерпретация хроматограмм проводилась7методом внутренней стандартизации по углеводороду С19 и С23 с помощьюпрограммы UniChrom. Статистическую обработку полученных данных выполнялиметодом главных компонент в программе Microsoft Excel 2010 c использованиемпрограммы Statistical analysis tool on Microsoft Excel (RIKEN Plant Science Center(Japan).
Анализ метаболитных профилей и построение теплокарт метаболитовбыли выполнены с использованием методов мультивариоционной статистики спомощью программы MetaboAnalyst. Все данные, полученные в 3-х биологическихи 3-х аналитических повторностях, обрабатывали статистически с использованиемпрограммы Excel XP Professional. В таблицах и на рисунках приведены средниеарифметические трех биологических повторностей и их стандартные отклонения.Достоверность различий между средними значениями оценивали с учетом tкритерия Стьюдента при р ≤ 0.05 и/или р ≤ 0.01.Результаты и обсуждениеИсследование влияния Cd и Zn на основные физиолого-биохимическиепоказатели растений Amaranthus cruentus и Amarnthus caudatusи ихустойчивость к действию металловНаши эксперименты показали, что 7 сут экспонирование растений напитательном растворе с внесением 90 мкМ Cd или 300 мкМ Zn вызывалоторможение прироста сырой биомассы надземных органов у A.caudatus в среднемна 35%, а у A.cruentus на 45-55% к контролю.
Еще сильнее (на 61-63%) подвоздействием Cd и Zn у A.cruentus ингибировался прирост сырой биомассы корней,в то время как у A.caudatus отставание составило в среднем 28% (Рис.1А). В то жевремя прирост сухой биомассы у A.caudatus тормозился в значительно меньшейстепени (в листьях- не более 10-18%) при отсутствии значимых различий в корнях(рис.1Б), тогда как у A.cruentus ингибирование прироста сухого вещества влистьях и корнях достигало соответственно 38% и 47% к контролю. Большеевлияния Cd и Zn на прирост сырой, чем сухой биомассы, указывает наиндуцируемые металлами нарушения водного обмена растений, что ранееотмечалось другими авторами (Vassilev et al., 1998; Poschenrieder, Barcelo, 1999).Полученные данные свидетельствовали в пользу большей устойчивости растенийA.caudatus к действию Zn и Cd в сравнении с A.cruentus.АБРис.1.
Влияние Cd и Zn на накопление сырой (А) и сухой (Б) биомассырастений амаранта (* p<0,05, **p<0,01).8Анализ содержания Cd и Zn в органах амаранта позволил установить, что обаметалла активно поступали в растения и в наибольших концентрацияхнакапливались в корнях (Рис.2). Аккумуляция Cd в корнях A.cruentus оказалась в1,4 раза выше, чем в корнях A.caudatus, однако перенос Cd в надземные органыбыл интенсивнее у A.caudatus. Цинк, напротив, предпочтительнее аккумулировалсякорнями A.caudatus, но более активно перемещался в побег у A.cruentus.
Несмотряна высокое содержание металлов среде, концентрация Cd не превысила 90,6 мкг/гв листьях A.caudatus и 27,0 мкг/г в листьях A.cruentus, а концентрация Znсоответственно 568 мкг/г и 215 мкг/г. Таким образом оба вида амаранта проявлялистратегию эксклюдера, аккумулируя Cd и Zn преимущественно на уровне корней.Рис. 2. Содержаниекадмия и цинка вкорняхинадземных органахрастений амарантаС целью оценки воздействия Cd и Zn на показатели минерального обменарастений было исследовано влияние этих металлов на содержание K, Ca, Mg вкорнях и надземных органах амаранта. Внесение Zn и особенно Cd существенноснизило концентрации макроэлементов в корнях и листьях A.cruentus, тогда как уA.
caudatus негативное воздействие металлов проявилось намного слабее (Рис.3).Особенно сильным (до 2,2 раз к контролю) оказалось снижение содержание K вкорнях A.cruentus (Рис.3А), что согласуется с сообщениями (Беляева и Игошина,2003; Li et al., 2012) об индукции кадмием утечки K из корней растений.Концентрации K, Ca и Mg снижались у A.cruentus до 1,5-2 раз не только в корнях,но и в листьях (Рис3Б), особенно в присутствии Cd. У A. caudatus негативноедействие Cd и Zn проявилось слабее и в основном в отношении аккумуляции K иMg, тогда как уровень Ca в корнях и листьях практически не менялся. Возможныммеханизмом нарушений ионного состава в органах амаранта может быть какблокирование кадмием ионных каналов, участвующих в поступлении K+, Ca2+иMg2+, обсуждаемое рядом авторов (Verbruggen et al., 2009; Lux et al., 2011), так игенерация конформационных изменений KOR каналов, ведущая к их открыванию(Liu et al., 2012), Полученные данные свидетельствуют в пользу большейметаллоустойчивости A.
caudatus, обусловленной, в том числе, более эффективнымподдержанием ионного гомеостаза в корнях и листьях этого вида амаранта.9АБРис. 3 Влияние кадмия и цинка на содержание макроэлементов в корнях (А)и листьях (Б) двух видов растений амаранта (* p<0,05, **p<0,01).Оксалат является важной составляющей при формировании ионного балансав листьях амаранта (Осмоловская и др., 2007). Результаты исследования показали,что Cd и Zn способствовали резкому сокращению фракции нерастворимогооксалата в листьях A.caudatus и A.cruentus (Рис.4А), и одновременномувозрастанию содержания в них пулов водорастворимого оксалата (Рис 4Б).
Эффектдеградации пулов нерастворимого оксалата в условиях Cd и Zn стресса несопровождался снижением концентрации Ca в листьях более устойчивогоA.caudatus (Рис.3Б), что аналогично эффекту, описанному для растений привоздействии стресса засухи (Tooulakou et al., 2016), и позволяет полагать, чтовыявленные изменения в пулах оксалата могут быть адаптивной реакцией ичастью метаболического отклика в листьях амаранта на Cd и Zn воздействие.абРис. 4. Влияние Cd и Zn на содержание нерастворимой (а) и растворимой (б)фракций оксалата в листьях амаранта.Роль условий минерального питания в ответных реакциях растений амарантана действие тяжелых металлов.Нами было исследовано влияние условий минерального питания, таких какформа источника азота и уровень рН среды, на показатели аккумуляции Cd и Zn вразных частях растений.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
