0712-orgreview (1144255)
Текст из файла
утверждАк): Проректор по научной работе Санкт-Петербургского отзыв вкду Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высп1его образования «Санкт-Петербургский государственный университет» на диссертацию Жемкова Владимира Андреевича «Структурные характеристики белков, вовлечбпных в нейродегенератнвные процессы, определяющие особенности пх межмолекулярных взаимодействий», представленную на соискание степени кандидата физикоматематических наук по специальности 03.01.02- «Биофизика».
Актуальность темы выполненной работы Нейродегенеративные заболевания (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и пр.) являются подлинным бичом нашего времени. Нам известно, что этнология этих заболеваний непосредственно связана с аберрантны ми белок-белковыми взаимодействиями, ведущими к образованию разного рода агрегатов ~среди которых наиболее известны бета-амилоиды). Грань, отделяющая норму от патологии, в данном случае очень тонкая. Когда заболевание носит наследственный характер, одна-единственная точечная мутация способна приводить к развитию болезни.
А когда заболевание носит спорадический характер гт.е. в подавляющем большинстве случаев), наши представления о том, что служит «спусковым крючком» для по~аления аберрантных белковых агрегатов, по сей день остаются весьма смутными. Прямым результатом такого положения дел является фактическое отсутствие действенной терапии: в лучшем случае мы можем лишь частично и временно компенсировать последствия нейроде генерации (например, используя прекурсоры допамина в случае болезни Паркинсона). С этой точки зрения получения любой информации о межмолекуляриых взаимодействиях белков, вовлечйнных в нейродегенеративные процессы, представляется крайне важным и интересным.
Структура и основное содержание диссертационной работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания используемых экспериментальных методов, описания основных полученных результатов, обсуждения результатов, раздела, содержащего основные выводы, и заключения. Объйм работы составляет 147 страниц, а список цитируемой литературы насчитывает 27б наименований. Стоит отметить, что структура диссертации представляется в этом случае не единственно возможной. В качестве альтернативного подхода, как нам видится, автор мог бы представить описание своих основных проектов в отдельных главах.
В такам случае каждая глава соответствовала бы одному из трех основных проектов, представляемых в данной диссертационной работе. Тем не менее, в своей настоящей форме рукопись полностью соответствует требованиям, предъявлемым к диссертационной работе, как по форме, так и по содержанию. В данной рецензии мы последовательно обсудим каждое из основных направлений, составляющих сугь представленной работы, 1.
Структура полиглутампн-содержащего участка в контексте структуры белка атаксии-3. Содержание исследования, научная новизна, основные достонкства н недостаткп. : Полиглугаминовые участки известны своим разупорядоченным характером и способностью к амилоидогенезу. В данном случае автору удалось получить кристаллическую структуру поли-О участка в двух различных формах: разупорядоченной форме и в форме альфа-спирали, дополнительно стабилизированной цепочкой водородных связей, образуемых боковыми цепями.
Особый интерес представляет из себя последняя конфигурация. ЕЕ существование было предсказано теоретически, однако автору удалось впервые продемонстрировать существование подобного структурного мотива эксперименгальным путем. Как выяснилось, формирование подобной спирали определяется Звмвчвннв н вопросы к ооноккпяю здесь н далев набраны курсивом стабилизирующими контактами, связанными с упаковкой кристаллической решбткн (в данном случае, упаковки с мальтозо-связывающим белком, который был использован в качестве белка слияния).
В свою очередь это означает, что наблюдаемая спираль нестабильна н может быть индуцнрована за счет слабо-специфичных взаимодействий белка (в данном случае атаксина-3) с белкамн-партнерами. Полученный автором результат представляет из себя открьпие мирового уровня, Особо следует подчеркнугь, что полученные ранее структуры поли-() спиралей имели достаточно низкое разрешение н не позволяли идентифицировать цепочки водородных связей, образуемых боковыми цепями. В то же время полученные автором структуры 4Уь9 н 4%ТН имеют разрешение 2.00 и 2.25 ангстрем, соответственно, что позволяет распознать искомый мотив.
Стоит отметить, однако, что взаимодействия, приводящие к образованию вышеописанной спирали, носят не-физиологический характер. Поиск систем, в которых подобная спираль формировалась бы в контексте биологически важных белок-белковых взаимодействий, Iредстажиет собой задачу длл дальнейших исследований. 2. Пептондные ингибиторы агрегацни хантнигтииа. Содержание исследовании, цаучнан новизна, основные достоинства и недостатки.
С практической точки зрения важнейшей задачей является разработка веществ, способных предотвратить агрегацню нейропатологических белков. При этом те участки последовательности, которые непосредственно вовлечены в процесс агрегации, представляют из себя неблагодарную мишень нбо они, как правило, разупорядочены. Решение этой проблемы возможно с помощью антител, которые способны преодолевать гематоэнцефалический барьер. Однако импорт антител внутрь нейронов представляет собой проблему, которая на данный момент не имеет удовлетворительного решения. В этой связи потенциальный интерес представляют пептидные соединения, для которых существует возможность (по крайней мере, теоретическая) таргетной доставки.
Ещй более привлекательным варишпом представляются пептидомиметики„которые в меньшей мере подвержены протеолитической деградации н выводу из кроветока. В данном контексте автор воспользовался библиотекой пептидомиметиков, насчитывающей ок, 60,000 вариантов (сннтезнрована сотрудником СПбГУ П.Р,Голубевым). Скрининиг этой библиотеки позволил выявить пептндомиметик НАР!, связывающийся с определбнной последовательностью в составе белка хантинггин. Следует особо отметить, что НМР! таргетироаан не к последовательности моли-Я в составе хантинггнна, непосредственно ответственной за агрегацию этого нейропатологического белка, а к предшествующему фрагменту цепи.
Тем самым обеспечивается потенциальнй специфичность НМР! по отношению к хантингтину. Автору удалось подтвердить связывание НХР1 с хантингтином "в пробирке", методом титрацнонной калориметрии. Автором также были проведены клеточные эксперименты, которые показывают, что обработка клеток линии НЕК293Т высокой дозой НХР! ведбт к примерно двукратному уменьшению агрегации хантигнтина (с целью детекцни клетки были трап сфицированы слиянием хантиггина с зеленым флуоресцентным белком ОРР).
Наконец, были поставлены эксперименты на нейронной модели УАС128, несущей патогенные мутации в составе хантинггина. Эта модель характеризуется пониженным количеством синаптических контактов. Обработка культуры с помощью НМР! позволила наблюдать восстановление нормальной плотности синаптических контактов (шипиков). Отметим, что получение пептидомиметика НЖР! представляет собой замечательное достижение как в отношении замысла исследования, так и в отношении технологии эксперимента. Однако в отношении дальнейших экспериментов стоит сформулировать ряд критических вопросов.
НЖР1 является водорастворммым соединением. Тем не менее счмтаетея„что оно свободно диффундирует сквозь клеточную мембрану. Выло бы желательно поставить контрольные эксперименты, демонстрмрующм» проникновение НФР1 внутрь клетки. Авторам стоит рассмотреть альтернативную гипотезу. Возможно, НЛР1 не проникает внутрь клетки м не взаимодействует с хантигнтином, а вместо этого влияет на физиологию кчеткм посредством других взаимодействий !например, посредством слабо-спемифичныл взаимодействий е определенными реяепторамм).
Наблюдаемое уменыаение агрегамии хантигнтииа может быть последствием такого рода общих изменений в физиологии клетки. Справедливости ради следует оговориться, что проверка подобной альтернативной гипотезы представляет собой весьма сложную задачу !ио крайней мере желательно показать, чво воздействие НЫР1 не влияет на основные параметры жизнедеятельности каетки — морфслогию, метаболизм и пр1 Аналогичные замечания можно высказать по отношению к экспериментам с моделью КАС128. В этой свлж было бы желательно представить данные на Рис.
14 с указанием статистической погрешности. 3 данный момент статистическая значимость этик результатов ясна не до конно. Белок-лнпндные взаимодействия рецептора сигма-1. Содержание исследования, научная новпзна, основные достоцнства и недостатки. Рецептор сигма-1, локализуемый преимущественно в эндоплазматичес ком ретикулуме, предположительно оказывает существенное влияние на процессы нейродегенерации. Однако в данный момент о механизмах действия этого рецептора и его физиологических лигандах известно очень мало. С целью структурных и функциональных исследований этого рецептора автор получил рекомбинантный белок сигма-1 с использованием бакуловирусной системы экспрессии, Автору также удалось реконструировать сигма-1 в липидных бислоях (липосомах).
Очевидно, исходной целью этой работы было решение кристаллографической структуры данного рецептора. Однако уже в ходе работы подобная структура была опубликована (Хашге 532, 527 (201б)). Тем не менее автору удалось переориентировать цели исследования и получить весьма интересные результаты. А именно, им было показано, что сигма-1 локализуется в холестериновых рафтах. При этом кластеризацию сигма-1 в присутствии холестерина удалось подтвердить прямым наблюдением, а ко-локализацию сигма-1 с холестерином удалось подтвердить косвенно, с помощью диффузионных экспериментов ГКАР, В качестве следующего шага, автор использовал вновь опубликованную структуру сигма-1 в сочетании с методами биоинформатики для того, чтобы идентифицировать потенциальные холестерин- связывающие последовательности в составе рецептора сигма-1. Затем он сконструировал несколько вариантов рецептора сигма-1, в которых были внесены изменения с целью нарушить взаимодействие этого рецептора с холестерином.
Трансфекция клеток НЕК293Т подобными вариантами рецептора сигма-1 показала, что эти изменения ведут к потере эффекта кластеризации. Дополнительные эксперименты показали, что рецептор сигма-1 локализуется в составе мембран ЭР, ассоциированных с митохондриями, и при этом регулирует контактную длину между ЭР и митохондриями. Необходимо подчеркнуть, что автор использует мощный и современный арсенал методов для исследования крайне интересной системы.
Тем не менее ряд вопросов оставлен в этой работе без ответа. Вопервых, не удалось подтвердить, чпю сигма-1 реконструирована в липосоме в "натиеной" форме ~соответствующей структуре 5ХХК11. Во-вторых, эксперименты ГОАР не обладают высокой точностью — с этой точки зрения желательно ко-локализовать рецептор сигма-1 с холестерином при помощи маркера филипин. В-третьих, остается недоказанным, что изменения в предполагаемой холестерин-связывающей последовательности сигма-1 действительно возымели желаемый эффект, т.е. нарушили связывание с холестерином.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
