Диссертация (1141476), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Помимоэтого, были отобраны образцы активного ила с действующих очистныхсооружений, работающих по технологической схеме одноиловой денитринитрификации. Шифры образцов, соответствующие определенным этапамисследования, приведены в таблице 3.4.Таблица 3.4 – Перечень шифров образцов ПЦР-анализаШифрЭтап исследованияТехнологический кислородный режим12.1-3DO ≈ 0,5 мг/л132.2-4DO ≈ 0,5 мг/л152.2-2DO ≈ 0,5 мг/л16-18К (действующие ОС)выделенныезонынитрификацииинитрификациииденитрификации172.1-4DO ≈ 0,35 мг/л19К (действующие ОС)выделенныезоныденитрификации24DO ≈ 0,5 мг/л (реальная вода)3Тестовая ПЦР с праймерами на 16S рРНК бактерий была проведена дляопределения оптимального разведения экстрагированной из активного илаДНК.
При разведении препаратов ДНК в 10 и 100 раз можно добитьсяуменьшенияэффектаконтаминации,частопроявляющегосяввидунедостаточной очистки ДНК. Для проверки были взяты по 1 повторностивсех образцов, образец 13 был взят в двух повторностях.Выявлена небольшая контаминация при амплификации неразведенныхпрепаратах ДНК некоторых образцов (1, 13.1 и 13.2, 15, 19), которая исчезалапри разведении в 10 раз. В связи с этим в дальнейшей работе в качествеДНК-матрицы, добавляемой в смесь для амплификации, были использованыразведенные в 10 раз препараты экстрагированной ДНК.
В таблице 3.5.99приведены результаты тестового определения количества копий ДНК впробах активного ила.Таблица 3.5 – Результаты тестовой ПЦРНомеробразца1.113.113.215.1КоличествобиомассыдлявыделенияДНК0,25 г250 мкл250 мкл0,25 гРазведениенеткопийбактериальной16S рРНК/гсубстрата1,22E+12Номеробразца16КоличествобиомассыдлявыделенияДНК250 мклРазведениенеткопийбактериальной16S рРНК/гсубстрата5,53E+11нет7,45E+11нет1,6E+12×101,27E+12×106,67E+11×101,41E+12×106,64E+11×1001,45E+12×1009,17E+11×100нет1,43E+12×100нет6,86E+11нет4,05E+11нет3,02E+11×104,37E+11×102,97E+11×104,41E+11×103,22E+11×1005,04E+11×1002,1E+11×100нет4,59E+11×100нет2,57E+11нет4,59E+11нет3,43E+11×105,26E+11×103,69E+11×105,81E+11×103,58E+11×1006,04E+11×1004,4E+11×100нет6,33E+11×100нет4,19E+11нет1,81E+11нет1,28E+11×102,37E+11×102,26E+11×102,46E+11×102,55E+11×1003,38E+11×1003,08E+11×1002,62E+11×100нет2,48E+114,09E+112,31E+111,35E+111817.119.124.1250 мкл0,25 г0,25 г250 мкл2,4E+113,25E+111,73E+111,62E+11нет2E+11×101,73E+11×101,68E+11×1001,93E+11×1001,12E+11Количественная ПЦР – рибосомальные гены бактерий и архей.Количество копий генов бактериальной 16S рРНК варьировалось впределах 1011-1012 копий/г субстрата (биомассы активного ила) для всехобразцов (рисунок 3.6).
Наибольшее количество бактериальных генов100наблюдалось в образцах 1, 13, 16-18. Показатель количества копий геновбактериальной 16S рРНК был использован при оценке относительногообилия генов, ассоциированных с процессами азотного цикла.копий гена бакт. 16S рРНК/гсубстрата1,4E+121,2E+121E+128E+116E+114E+112E+1101131516-18171924Рисунок 3.6 – Количество копий генов бактериальной 16S рРНК в образцах,усредненное для 2х повторностей выделения ДНК и 2 повторностей ПЦРКоличество копий генов архейной 16S рРНК было наибольшим вобразце 13 (6,73*1010 копий/г субстрата) (Рисунок 3.7). В образцах 1, 16, 18 и24 количество генов архей варьировало в пределах 1,55-2*1010 копий/гсубстрата.
В образцах 15, 17, 19 количество генов архей было наименьшим(порядка 109 копий/г субстрата).копий гена арх. 16S рРНК/гсубстрата8E+107E+106E+105E+104E+103E+102E+101E+1001131516-18171924Рисунок 3.7– Количество копий генов архейной 16S рРНК в образцах,усредненное для 2х повторностей выделения ДНК и 2 повторностей ПЦР101Количественная ПЦР – функциональные гены бактерий и архей,связанные с нитрификацией.Количество копий гена amoA бактерий значимо различалось висследуемых образцах.
Наибольшее количество было обнаружено в образце24 (3,38*108 копий amoA бактерий/г субстрата). В образцах 1, 3, 16, 18количество копий гена amoA составляло 2,4 – 5,5*107 /г субстрата.Наименьшее количество amoA (около 106 /г субстрата) выявлено в образцах15, 17, 19 (рисунок 3.8.).При относительной оценке количества генов, ассоциированных спроцессом нитрификации, выявлено наибольшее соотношение междуколичеством копий рибосомальных генов бактерий и копий гена amoA вобразце 24.Гены amoA архей в количестве, близком к пределу детекции, быливыявлены только в образце 13.log (копий amoA бакт.)/гсубстрата987651131516-18171924Рисунок 3.8 – Количество копий гена бактериального amoA в образцах,усредненное для 2х повторностей выделения ДНК и 2 повторностей ПЦР102amoA бакт./16S рРНКбактерий0,00120,0010,00080,00060,00040,000201131516-18171924Рисунок 3.9 – Соотношение количества копий гена amoA бактерий в образцахк количеству копий гена бактериальной 16S рРНККоличественная ПЦР – функциональные гены бактерий, связанные сденитрификацией.Количество копий генов nirK было наибольшим в образцах 13 и 24 (до1011 копий гена nirK/г субстрата).
В остальных образцах его количествоварьировало в пределах 1,8 – 4*1010 копий гена nirK/г субстрата.Соотношение количества nirK и 16S рРНК бактерий было наибольшим вобразцах 13 и 24, соотношения генов в остальных образцах значимо неразличались.Количество копий генов nirS также было наибольшим в образцах 13 и24 (9,1*109 и 3,6*109 копий гена nirS/г субстрата, соответственно).
Среднееколичество копий генов nirS было выявлено в образцах 1 и 16-18 (1 – 2*109копий гена nirS/г субстрата). Наименьшее количество копий генов nirS быловыявлено в образцах 15, 17 и 19 (2 – 5*108 копий гена nirS/г субстрата)(рисунок 3.12).Наибольшее соотношение количества nirS и 16S рРНК бактерийнаблюдалось в образцах 13, 24, 16-18 (рисунок 3.13)103копий nirK/г субстрата1,4E+111,2E+111E+118E+106E+104E+102E+1001131516-18171924Рисунок 3.10 – Количество копий гена nirK в образцах, усредненное для 2хповторностей выделения ДНК и 2 повторностей ПЦРnirK/16S рРНК бактерий0,30,250,20,150,10,0501131516-18171924Рисунок 3.11 – Соотношение количества копий гена nirK в образцах ккопий nirS/г субстратаколичеству копий гена бактериальной 16S рРНК1E+109E+098E+097E+096E+095E+094E+093E+092E+091E+0901131516-18171924Рисунок 3.12 – Количество копий гена nirS в образцах, усредненное для 2хповторностей выделения ДНК и 2 повторностей ПЦР104nirS/16S рРНК бактерий0,0160,0140,0120,010,0080,0060,0040,00201131516-18171924Рисунок 3.13 – Соотношение количества копий гена nirS в образцах кколичеству копий гена бактериальной 16S рРНКПо полученным данным можно сделать заключение о соотношенииобилия групп микроорганизмов в образцах активного ила по количествукопий рибосомальных генов.
При этом вариации числа рибосомальныхоперонов в геномах бактерий и архей сказываются на оценке численностимикроорганизмов.Оценка количества функциональных генов в образцах активного илахарактеризует потенциальную способность микробиома активного ила косуществлению того или иного процесса. Вариации в числе копий гена вединичном геноме при этом не имеют особого значения.Количествокопийрибосомальныхгеновбактерийявляетсяхарактеристикой общего обилия бактерий в образцах. Способ отборабиомассы для выделения общей ДНК (навеска или аликвота суспензииактивного ила) не повлиял на этот показатель, что свидетельствует ободинаковой эффективности экстракции в обоих случаях.Количество копий рибосомальных генов архей различалось для разныхобразцов.ВразнообразиемдоменArchaeaфункцийвходят(метаногенез,микроорганизмынитрификация),сбольшимспособныексуществованию в широком спектре условий среды.
Их численность не таквелика по сравнению с численностью бактерий, однако есть данные, чтонитрифицирующие археи более активны, чем нитрифицирующие бактерии105[87]. Следовательно, археи являются технологически значимым компонентоммикробиома активного ила наряду с бактериями, что особенно важно встрессовых условиях одновременной нитрификации и денитрификации.Согласнооценкеколичествакопийгенов,ассоциированыхснитрификацией и денитрификацией, выявлены образцы активных илов,обладающие наибольшей потенциальной активностью к осуществлению этихпроцессов. В образце 24 обнаружена высокая потенциальная активность книтрификации и к денитрификации, обусловленная высокой численностьюкопий генов amoA бактерий, nirK, nirS.
В образце 13 выявлено большоеколичество копий генов, ассоциированных с денитрификацией, количествокопий гена amoA бактерий было относительно невелико. Однако в этомобразце были детектированы гены архейной amoA и высокая численность16S рРНК архей, что может свидетельствовать о доминировании архейныхнитрификаторов в микробном сообществе образца 13.Сравнительный анализ показал, что при одновременной нитрификациииденитрификации,втомчисленареальнойводе,количествосоответствующих ДНК примерно сопоставимо с системой, работающей поклассической технологии, при этом скорости реакций в низкокислородныхрежимах чуть ниже, что объясняется условиями работы активного ила, а неего составом.
Повышенное количество архей благоприятно сказывается наэффективности нитрификации, так как такая система становится болееадаптированной к стрессовым условиям при пониженных концентрацияхрастворенного кислорода.Для выявления зависимостей эффективности процессов одновременнойнитрификации и денитрификации и размеров флокул, а также выявлениярежимов работы, способствующих росту флокул крупных размеров, былвыполнен сравнительный анализ распределения размеров флокул методомлазерной дифракции.106Результаты эксперимента представлены в виде интегральных идифференциальных кривых распределения частиц по размерам рисунки 3.143.20).Рисунок 3.14 – Распределение размеров флокул (этап 1.2-3)Рисунок 3.15 – Распределение размеров флокул (этап 2.1-3)Рисунок 3.16 – Распределение размеров флокул (этап 2.1-4)107Рисунок 3.17 – Распределение размеров флокул (этап 2.1-4)Рисунок 3.18 – Распределение размеров флокул (этап 1.2-4)Рисунок 3.19 – Распределение размеров флокул (этап 2.2-4)108Рисунок 3.20 – Распределение размеров флокул (этап 2.2-2)Усредненные результаты гранулометрического анализа для разныхэтапов эксперимента приведены в Таблице 3.4.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
