Диссертация (1141130), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Для восстановления этих структур хирургунеобходимо обладать знаниями о различных биоматериалах, технологияхих изготовления, а также об их преимуществах и недостатках.32Глава 2. Материалы и МетодыИсследование включало три этапа:I.
На первом этапе проведена разработка полимерного каркаса изполи-3-оксибутирата (ПОБ), исследование его in vitro на цитотоксичность иin vivo на биосовместимость на мягких тканях бедренной кости крыс.II. На втором этапе были отработаны новые методики операции ипроведено экспериментальное исследование критических дефектов начерепах крыс с применение полимерного каркаса из ПОБ.III. В итоге на третом этапе проведено экспериментальноеисследование критических дефектов на черепах крыс с применениемкостного каркаса из ПОБ совместно с МСК.2.1.
Методики приготовления различных скаффолдов на основеПОБДля экспериментальных in vitro и in vivo исследований былиразработаны матриксы, имеющие различное строение и состав.В работе были использованы следующие материалы: Поли-3-оксибутират(ПОБ,М=147кДа),полученныйбиотехнологическим путем и предоставленный лабораторией биохимииазотфиксации микроорганизмов Института биохимии им. А.Н.
Баха РАНФИЦ Биотехнологии РАН [Bonartsev A.P., Zharkova I.I., 2017]; Альгинат натрия (Сигма-Алдрич, Германия); Трихлорметан (EKOS-1, Russia); Карбонат аммония (Химмед, Россия); Сахароза (Химмед, Россия); Гидроксиапатит (Сигма-Алдрич, Германия); Стрэнг из полилактида для 3D печати методом послойногонаплавления (температура плавления 200-255°С , плотность 1,2-1,08 кг/м2),(Московский завод FDPlast, Россия);33 МСК выделины из костного мозгах 3-х дневных крысят; Рометар (Bioveta, Чехия); Золетил 100 (Virbac, Франция); Доксициклин (Бинергия ЗАО, Россия); Тетрациклин (Биохимик ОАО, Россия); Ализариновый красный (ХимМедСервис, Россия); Цефазолин (Sandoz, Австрия).2.1.1.
Получение скаффолдов в виде гранулЧастицы получали при помощи метода «водная фаза/маслянаяфаза/воднаяфаза»,споследующимвымыванием.Вкачествепороборазователя был выбран водный раствор карбоната аммония, ввидуего способности к термическому разложению до аммиака и углекислогогаза.БылприготовленхлороформенныйрастворполимераПOБ,молекулярной массы 300 кДа и концентрации 120 мг/мл. Для преодоленияограничения по вязкости, раствор с концентрацией 50 мг/мл был упарен нароторном испарителе.
Также был приготовлен 5% (w\v) раствор карбонатааммония в воде.Для того, чтобы загрузка частиц наногидроксиапатитом произошларавномено, и избежать агломерации наночастиц, навеска 120 мг нГА быладиспергированав1млчистогохлороформа,споследующимразмешиванием на высокоскоростном гомогенизаторе IKA T 25 digital UltraTurrax.
Далее к суспензии были добавлены 4 мл хлороформенногорастовора ПOБ и производилось перемешивание 5 минут при 15 000 об/мин.По истечении времени в смесь были добавлены 2,2 мл 5% раствора(NH4)2CO3. После еще 15 минут гомогенизации, полученный сложныйколлоид по каплям добавляли в 1% (w/v) раствор ПВС при постоянномперемешивании на верхнеприводной мешалке R2R 2021 (Heidolph,34Германия) при скорости 450 об/мин. После полного испарения хлороформачастицы были отделены от эмульгатора (ПВС) путем осажденияцентрифугированием и промывки дистиллированной водой. Для полноговыхода порообразователя, структуры были подвергнуты кипячению.Готовые частицы проверяли на наличие следов карбоната аммонияпутем помещения в раствор фенолфталеина. По отсутсвию розовогоокрашивания был сделан вывод о полном удалении порообразователя.Далее частицы лиофилизировали, используя Freeze dryer ALPHA 1-2 LDplus(Германия), предварительно заморозив их в жидком азоте (рис.1).Разработка методики получения частиц на основе ПОБ былапроведенасовместносгруппойв.н.с.БонарцеваА.П.кафедрыбиоинженерии Биологического факультета МГУ им.
М.В. Ломоносова.35Рисунок 1. Изготовлениегидроксибутирата (ПГБ)первичныхматриксовнаосновеполи-3-2.1.2. Изготовление скаффолдов сложной геометрической формыДля получения пористых матриксов была использована новаямодификация широко применяемого для изготовления матриксов втканевой инженерии метода выщелачивания [Nam Y.S., 2000; Park J.K.,2002; Hou Q., 2003; Nublat C.
et al., 2006] – метод двойного выщелачивания[Kundu et al., 2013] с использованием в качестве порообразующих агентовкарбоната аммония и сахарозы. Размер кристаллов карбоната аммониясоставлял 40-94 мкм, сахарозы – 94-315 мкм. Нормирование размеров36производилось с помошью лабораторных сит с ячейками 40, 94 и 315 мкм(U1-ESL(Крафт,Россия).Напервойстадииметодадвойноговыщелачивания происходит термическое разложение карбоната аммония((NH4)2CO3 → 2NH3 + CO2 + H2O) – при этом образуются поры меньшегодиаметра.
После чего, на второй стадии, воду меняли несколько раз дополного вымывания сахарозы [Жаркова И.И., 2017] (рис.2).Раствор ПОБ 65 мг/мл в трихлорметане добавляли к смеси карбонатааммония и сахарозы (1:3) до состояния смеси близкому к жидкой пасте.Этой смесью заполняли форму, изготовленную ранее. После испарениярастворителя, форму погружали в горячую воду (~90°С).Послепрекращения газообразования полученные матриксы удаляли из формы ипромывали дистиллированной водой 5 х30 мин на шейкере.Для получения матриксов, содержащих гидроксиапатит (ГА), растворПОБ 65 мг/мл в трихлорметане диспергировали совместно с ГА вконцентрации 6,5 мкг/мл, т.е. соотношение ГА к ПОБ составляло 1:10.
Такоесоотношение было выбрано на основании литературных данных ипроведенных ранее исследований, как наименее токсичное для МСК и приэтом придающая матриксам остеокондуктивные и остеоиндуктивныесвойства [Blaker J.J., 2005; Huang Y.X., 2008].Перед имплантацией матриксы заполняли 1% раствором альгинатанатрия до полного насыщения и затем помещали в 5% раствор CaCl2 дополного гелирования альгината в матриксе, после чего полученныйгибридный матрикс промывали ФБС.Подобная гибридная конструкция из матрикса на основе ПОБ,заполненного альгинатом натрия была разработана с учетом ранееполученных данных [Kundu et al., 2013; Gazhva J.V., Bonartsev A.P., 2014].Нами было показано, что барьерная мембрана из ПОБ и паста длязаполнения костных дефектов на основе микросфер из ПОБ в альгинатномгеле являются эффективными для регенерации костной ткани.
Кроме того,37альгинат может быть использован в дальнейшем в качестве средства дляинкапсулирования и введения в матрикс мезенхимальных стволовых клетоки других клеток, используемых для стимуляции регенерации костной ихрящевой тканей [Bai H.Y., 2010].Разработка методики получения пористых матриксов на основе ПОБи его композита с ГА была проведена совместно с группой в.н.с. БонарцеваА.П. кафедры биоинженерии Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.Рисунок 2. Метод двойного выщелачиванияКомпьютерноемоделированиеи3Dпечатьформдляизготовления костных имплантатов при критических дефектах начерепах крысПроведена конусно-лучевая компьютерная томография головыкрысы.Сканирование проводили в конусно-лучевом томографе Point 3DCombi 500 C, (Pointnix, Ю.
Корея) на отработанном режиме 63kVp/7mA.Наоснове DICOM файлов проведена реформация 3D модели черепа используяпрограммное обеспечение Horos Project-Free DICOM Medical Image Viewer(рис. 3). По центру теменной кости смоделирован костный дефект38цилиндрической формы диаметром 8 мм с высотой 1,5 мм (рис.
4). Модельимплантата смоделирована таким образом, чтобы не только заполнятькостный дефект, но также перекрывать его снаружи. Это позволялозащитить твёрдую мозговую оболочку и головной мозг от внешнеговоздействия (рис. 5). Так как дальнейшее исследование проводилось накрысах одной массы и размера, все модели были изготовлены одногоразмера. На рисунке 6 представлена 3D модель формы для изготовления КИ.[Мураев А.А., Бонарцев А.П., Стамболиев И.А., 2016].Рисунок 3. 3D череп крысы, Рисунок 4. Модель черепа крысы среформированный из DICOM искусственно смоделированным дефектомфайловРисунок 5. 3D модель костного имплантата.А – вид снизу, Б – вид с боку и сверху, В – видсбоку и снизу.
Верхняя часть имплантата,будетперекрыватькостныйдефектзащищая головной мозгРисунок 6. 3D модель формы для отливкиимплантатов39Изготовление костных имплантатов по напечатанным 3DформамС использованием 3D принтера PrusaMendel v2, работающего попринципу послойного наплавления,полилактида.былиизготовленыТак как в процессе изготовления КИформыизприменяетсяорганический растворитель хлороформ, растворяющий полилактид, формыбыли изолированы алюминиевой фольгой (рис.7, 8) [Мураев А.А., БонарцевА.П., Стамболиев И.А., 2016].Рисунок 7. Форма для отливки Рисунок 8.имплантатов на этапе печатиимплантатовФормадляотливкиТакой процесс отливки имплантатов легко масштабируется дляизготовления имплантатов размером не менее 5х5х5 мм.Методынасыщенияскаффолдовальгинатанатрия,гидроксиапатита и МСКМатриксы на основе ПОБ обладают только остеокондуктивнымисвойствами[Chen GQ., 2005].
Для придания остеоиндуктивных свойствполучали композитные матриксы с ГА и заполняли их альгинатнымгидрогелем, содержащим МСК [Чеснокова Д.В., Стамболиев И.А., 2018;Стамболиев И.А., 2018].Метод введения МСК в матриксы заключался в том, что на стадиизаполнения пористых скэффолдов из ПОБ/ГА/АЛГ, в скэффолды вводилиМСК, предварительно помещенные в 1% альгинат натрия. Порошок40альгината натрия (Сигма-Алдрич, Германия), стерилизованный в спирте ипод ультрафиолетом, растворяли 6 часов при перемешивании на магнитноймешалке в физиологическом растворе в концентрации 1,5% в стерильныхусловиях в ламинарном шкафу.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
