Диссертация (1140827), страница 7

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 7)

Дисбактериоз кишечника».Сбор материала для исследования осуществляли следующим образом.Кал для исследования отбирали в стерильную посуду (стекляннуюмногоразовогоприменения).использованияМногоразоваяилипосудапластмассовуюдляпробкалаодноразовогостерилизоваласькипячением, автоклавированием или сухим жаром. Перед стерилизацией этупосудунеобрабатывалидезинфицирующимирастворами.Послепериодической обработки посуды щелочами или кислотами, например,содой, хромпиком и др., тщательно и многократно промывали ееводопроводной водой, прополаскивали дистиллированной водой и толькозатем стерилизовать нагреванием. Количество кала, присылаемого дляисследования, составляло 3-5 г.

Материал доставляли в лабораторию непозже, чем через 1 час после отбора пробы. При невозможности доставки вуказанные сроки допускалось хранение образцов кала при +4°С не более 6часов от момента получения пробы.Из доставленного в лабораторию в стерильной посуде образца калаготовили навеску 0,5 или 1,0 г.

Навеска вносилась во флакон с рассчитаннымзаранее количеством буферного раствора, содержащего тиогликолевуюкислоту, и тщательно гомогенизировалась на механической качалке.Количество раствора рассчитывалось исходя из пропорции 1:10.Дляприготовлениясерийныхразведенийбрали8-9чистых,стерильных химических пробирок.

В каждую пробирку вносили 4,5 мл44буферного раствора. Из пробирки с уже имеющимся (первым) разведениемпереносили 0,5 мл гомогенной взвеси к буферному раствору во второйпробирке. Содержимое второй пробирки тщательно перемешивали пипеткой,которую затем сбрасывали в дезинфицирующий раствор. В случаезатруднения при заборе из первого разведения использовали пипетку сотбитым кончиком. Аналогичным образом приготавливались остальныеразведения. Обычно использовали восемь разведений.

При необходимости(например, сливной рост в 8 разведении) количество разведений увеличивалидо необходимого числа.Посев материала на питательные среды. Из полученных разведений,начиная с последнего, одной пипеткой (объемом 1см3) сеяли по 1 капле насоответствующие питательные среды, а затем чашку с посеяннымматериалом подсушивали и ставили в термостат.

Для более точногокачественногоанализавсехвариантовкишечныхпалочек,цитратассимилирующих энтеробактерий, гемолизирующих форм бактерий,бактероидов и пептострептококков дополнительно высевали по 1 капле из4, 5, 6 и 7 разведений на соответствующие питательные среды и равномернораспределяли каплю бактериальной суспензии с помощью стеклянных буспо всей поверхности питательной среды. Этим достигался рост напитательнойсредемикроорганизмовввидеотдельныхколоний,представляющих собой чистую культуру того или иного штамма кишечныхбактерий.

Исключение составляли пробирочные среды: Вильсон-Блер иБлаурокка. Для первой – перед посевом в три пробирки вносился по 0,5 мл20% раствора тиосульфата натрия и по 1 капле 8% раствора хлорида железа.Затем в каждую пробирку вносилось по 1 мл материала из соответствующихразведений. После чего все заливалось заранее растопленной и охлажденной(до 60-500С) основой среды Вильсон-Блер.

Содержимое пробирки тщательноперемешивалось путем вращения пробирки между ладонями.45ПробиркисосредойБлаурокка,заранееразлитойипростерилизованной автоклавированием, ставились в водяную баню, где онирегенерировались в течении 30 мин с момента закипания. Это делалось дляудаления остаточного количества кислорода, растворенного в среде.

Затем востуженную до комнатной температуры среду вносилось по 1 мл материалаизсоответствующегоразведения.Изучаемыемикробиологическиепоказатели, питательные среды, используемые разведения и условиякультивирования различных микроорганизмов представлены в таблице 7.Таблица 7Рекомендуемые микробиологические показатели, питательные среды иусловия культивирования фекальных микроорганизмовИзучаемые группыПитательныеРазведениямикроорганизмовсредыфекалий для культивипосевабактероидыАнаэробный агарПосуда, количествопитательной средырования37°С, 48 часовЧашки Петри, 20-107, 108анаэробные25мл10 5 ,10 637°С, 48 часовЧашки Петри, 20-анаэробные25мл37°С, 48 часовБактериологическиеанаэробныепробирки, 9 мл37°С, 24Бактериологичечасаские пробирки,анаэробны9 млОблигатные анаэробы:Условия(типа Шадлера) сканамицином иванкомициномпептококки,Анаэробный агарпептострептококки,(типа Шадлера) свейлонеллыколимициноми налидиксовойкислотойбифидобактерииСреда Блаурокка,10 6 , 10 8модифицированнаяклостридииСреда ВильсонБлера104, 106, 108е46Факультативные анаэробы:кишечные палочкиСреда ЭндолактозонегативныеСреда СиммонсаУПБ*(цитратный агар )стафилококкиЖелточно-солевой37°С, 24 часаЧашки Петри, 20-25аэробныемл37°с, 48 часовЧашки Петри, 20-25аэробныемл102, 104, 106102, 104, 106агар (средаЧистовича)энтерококкиАзидовый агар103, 105, 10737°С, 72 часаЧашки Петри, 20-25Гемолитические штаммыКровяной агар103, 105, 107аэробные37°С,24 часамлЧашкиПетри, 20-25аэробныемлСреда для молочно- 105, 10737°С, 48 часов,Чашки Петри, 20-25кислых бактерийСО2 атмосферамл35°С, 48 часовЧашки Петри, 20-25аэробныемлбактерийМикроаэрофилы:лактобактерии(типа MRS)Грибы дрожжеподобныеСреда Сабуро с102, 104, 106пенициллином истрептомициномПримечание: *УПБ – условно-патогенные бактерииКолонии микроорганизмов, выросшие на питательных средах привысевеизнаибольшихразведений,подвергалиидентификациидляопределения их таксономической принадлежности к указанным в таблице 7группам кишечной микрофлоры.

Для этого оценивали возможности ростабактерий в аэробных и анаэробных условиях, их отношение к окраске пометоду Грама, характер роста на селективных средах, продукцию каталазы,цитохромоксидазы, особенности роста на OF-среде, продукцию индола,сероводорода, утилизацию цитрата натрия,подвижности[35].Биохимическуюотсутствие или наличиеидентификациючистыхкультуркишечных бактерий и дрожжеподобных грибов проводили с использованиемручных и автоматизированных тест-систем фирмы Becton Dickinson (США).Стандартом для проверки пригодности используемых питательных средслужили соответствующие лиофилизированные культуры микроорганизмов47из American Type Culture Collection (ATCC) – BBL QualiSwab (BectonDickinson, США).Референсный состав нормальной микрофлоры кишечника человекапредставлен в Приложении 1.Оценку степеней микробиологических отклонений поводили по ОСТ1500.11.0004-2003 «Протокол ведения больных.

Дисбактериоз кишечника»(Приложение 2).На основании критериев вышеприведенного ОСТ в подгруппахбольных определяли I, II, III степени дисбиоза; для более точной картиныфазы и формы дисбиотического процесса выделяли также переходные I-II иII-III степени.3.2. Методы иммунологического исследованияОбразцы периферической крови для иммунологических исследованийотбирали при поступлении (10-5-е сутки до операции), затем на 3-5-е и 30-35е сутки после хирургического вмешательства.

Всего было исследовано 150образцов крови.Иммунологическиеисследованиявыполнялииоценивалиихрезультаты в соответствии с принципами, изложенными в руководстве поклинической иммунологии [38].Иммунофенотипированиелимфоцитовпериферическойкровипроводили методом проточной лазерной цитометрии на приборе FACScan(Becton Dickinson, США) с использованием двухцветного реагента Simultest(флуоресцеин-изотиоцианат, фикоэритрин) (Becton Dickinson, США).Фагоцитарную активность нейтрофилов определяли по их способностипоглощатьклеткиStaphylococcusaureus,меченныефлуоресцеин-изотиоцианатом, на проточном цитометре FACScan (Becton Dickinson,США).48Исследования выполняли на базе лаборатории иммунологии ирегуляторных механизмов в хирургии Российского научного центрахирургии имени академика Б.В.Петровского (руководитель – Заслуженныйдеятель науки России, профессор Л.И.Винницкий).

Для сопоставленияполученных результатов иммунологических исследований с показателямиздоровых доноров использовали референсные значения, принятые вуказанной лаборатории как условная норма.3.3. Методы статистической обработки результатов исследованияВвод, статистическую обработку и анализ данных проводили спомощью «Система микробиологического мониторинга «МИКРОБ» [33], атакже с помощью программы Statistica 8 (StatSoft Inc) в соответствии собщепринятыми методами биомедицинской статистики [3].Данные микробиологических исследований представлены в видесредней ± стандартная ошибка средней (М±m); данные иммунологическихисследований представлены в виде средней ± стандартное отклонение(М±SD).Межгрупповыесравненияпоколичественнымхарактеристикампроводили с помощью критериев Манна-Уитни и Вилкоксона длянезависимых и связанных выборок, соответственно.

При сравнениинезависимых выборок по качественным признакам использовали критерий χ2с поправкой Йейтса и точный критерий Фишера. При анализе связипеременных рассчитывали коэффициент корреляции Спирмена.Нулевая гипотеза отвергалась при p≤0,05.49РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙГлава 1. Влияние Биона 3 на состояние кишечной микрофлоры убольных колоректальным раком в периоперационном периодеДля подтверждения или опровержения наличия микроэкологическогодисбаланса толстой кишки у отобранных нами больных КРР, мы провелимикробиологическое исследование их фекалий при поступлении в стационар.Полученные результаты сопоставляли с референсными показателями,определёнными в серии работ по изучению нормоценоза толстой кишки уздоровых лиц [20, 25, 31].

Характеристики

Список файлов диссертации