Диссертация (1140625), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Пациентки осматривалисьврачом гинекологом для исключения ВЗОМТ.43Специальное гинекологическое исследование, в дополнение к методамоценкисостоянияполовыхорганов,включалоизучениехарактераменструального цикла, проведение ультразвукового исследования (УЗИ) матки ипридатков для подтверждения или исключения наличия восходящей инфекцииорганов малого таза. Данное исследование проводилось аппаратом УЗИ SamsungMdison Accuvix V10 с использование датчиков наружного сканирования с рабочейчастотой 3,5 МГц и полостного ректально-вагинального с частотой 5 МГц исравнивалось с нормальными показателями.2.2.3.
Лабораторные исследованияЛабораторные исследования осуществлялись в центре молекулярнойдиагностикиинфекционныхзаболеванийФБУНЦентральногонаучно-исследовательского института эпидемиологии Роспотребнадзора.В качестве исследуемого материала у женщин являлся соскоб из уретры,цервикального канала, отделяемое из влагалища. Забор клинического материалапроводился стерильным универсальным гинекологическим зондом, независимо отдня менструального цикла, исключая дни менструации, при условии отсутствияместного и системного антибактериального лечения минимум в течениепоследних 3-х недель.Микроскопическое исследование использовали для оценки наличия истепени выраженности лейкоцитарно-воспалительной реакции и состояниямикробиоценоза уретрального, вагинального и цервикального отделяемого.Полученный материал наносили на предметные стекла из каждого локуса.Микроскопия клинических образцов проводилась с окраской по Граму.
На первомэтапе фиксированный мазок окрашивали генциановым фиолетовым в течении 1-2минут, на втором - обрабатывали раствором Люголя с продолжительностью в 1-2минуты. На третьем этапе обесцвечивали спиртом примерно 20 секунд споследующим обильным промыванием под водой. На четвертом – окрашиваливодным раствором фуксина.44Препарат просматривали с использованием светового микроскопа LevenhukLabZZ M2.
Учитывались следующие параметры: количество эпителиальныхклеток, лейкоцитов, слизь, микрофлора, «ключевые клетки», споры и мицелийдрожжеподобных гриба рода Candida, гонококки, трихомонады.Диагностическим критерием, подтверждающим наличие уретрита, являлосьобнаружение более 5 полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЯЛ) при просмотреболее 5 полей зрения при увеличении микроскопа х 1000.Критерием, подтверждающим диагнозы вагинита и цервицита, былообнаружение 10 и более ПМЯЛ при просмотре более 5 полей зрения приувеличении микроскопа х 1000.Культуральноеисследование.Дляопределениякачественногоиколичественного состава бактериальной биоты влагалища и цервикального каналапроводили посевы отделяемого на стандартные питательные среды.
Для ростааэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов использовали сахарныйагар с добавлением 5% донорской крови.Все чашки Петри с посевами инкубировали в термостате при температуре37о С, просматривая через 24-48-72 часа (по мере появления роста) иколичественно проводили оценку роста колоний различной морфологии. Степеньмикробной обсемененности определяли в колониеобразующих единицах впересчете на 1 мл отделяемого влагалища (КОЕ/мл).Идентификацию по видам выделенных микроорганизмов проводили,используя номенклатуру Берги и руководства по клинической микробиологии.ДлягрупповойпринадлежностиЕntеrоbаctеriаcеаеиспользовали12биохимических тестов, по результатам которых судили о способности штаммовферментировать глюкозу, маннит, лактозу, сахарозу, мальтозу, разлагатьмочевину, малонат натрия и расти на цитратном агаре Симонса.Для идентификации Staphylococcus по видовому составу учитывали пигмент,способность коагулировать плазму, гемолитическую активность и продукциюлецитиназы.45Для групповой идентификации Streptococcus использовали способностьредуцировать 1% метиленовый синий в молоке, гиппурат-тест, а также латексагглютинациюнастеклеидентификацииEnterococcusсгрупповымииспользовалисыворотками.тестыДляШерманавидовой(сбраживаниеманнита, сорбита, способность к пептонизации молока, способность к гемолизуэритроцитов, рост в 40% желчном бульоне).Молекулярно-генетическое исследование методом полимеразно-цепнойреакции (ПЦР) в режиме «реального времени» (real-time) использовали с цельюдетекции ДНК патогенных (С.
trаchоmаtis, N. gоnоrrhоеае, T. vаginаlis, М.gеnitаlium) и условно-патогенных микроорганизмов (Ureaplasma urеаlitycum,Mycoplasma hоminis, Ureaplasma pаrvum, Gardnerella vаginаlis, Atopobium vaginae,Streptococcus spp., Enterobacteriaceae spp., Staphylococcus spp., Candida spp.)урогенитального тракта, позволяя оценить качественно-количественный составмикробиоты.У женщин материалом для исследования данным методом диагностикиявлялся соскоб из цервикального канала и влагалищное отделяемое, помещаемыев один эппендорф объемом 1,5 мл с 0,5 мл специальной транспортной среды смуколитиком.На этапе выделения ДНК микроорганизмов из образцов урогенитальныхсоскобов использовался набор реагентов «АмплиПрайм ® ДНК-сорб-АМ» (Рег.уд. ФСР 2012/14204 от 27.12.2012 г.).Амплификация нуклеиновых кислот проводилась на амплификаторе врежиме «реального времени» «Rotor-Gene Q» с наличием 4-х независимыхканалов флуоресцентной детекции с использованием наборов следующихреагентов серии «Флороценоз»:•определение ДНК Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis,Mycoplasma genitalium и Trichomonas vaginalis методом ПЦР осуществлялось спомощью «АмплиПрайм® NCMT» (Рег.
уд. РЗН 2015/3168 от 13.10.2015);•определение ДНК Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealyticum иMycoplasmahominisметодомполимеразнойцепнойреакции(ПЦР)46осуществлялось с помощью «АмплиПрайм® Флороценоз-Микоплазмы» (Рег.уд.РЗН 2015/3164 от 13.10.2015);•определениеДНКGardnerellavaginalis,Atopobiumvaginae,Lactobacillus spp. и общего количества бактерий (Bacteria) методом ПЦРосуществлялосьспомощью«АмплиПрайм®Флороценоз-Бактериальныйвагиноз» (Рег. уд.
РЗН 2016/3619 от 29.01.2016);•определение ДНК энтеробактерий, стафилококков и стрептококковметодом ПЦР осуществлялось с помощью «АмплиПрайм® Флороценоз-Аэробы»(Рег. уд. РЗН 2015/3162 от 13.10.2015);•определение ДНК грибов рода Candida (C.albicans, C.glabrata,C.crusei, C.parapsilosis и C.tropicalis) методом ПЦР осуществлялось с помощью«АмплиПрайм® Флороценоз-Кандиды» (Рег. уд. РЗН 2015/3167 от 13.10.2015).Амплификация участков ДНК выявляемых микроорганизмов проводиласьодновременно с ДНК β-глобинового гена, который использовался в качествеэндогенного внутреннего контроля, позволял контролировать все этапы ПЦРисследования и оценивать адекватность взятия биологического материала и егохранения.Количественное определение ДНК в клинических образцах в режиме«реального времени» основывалось на существовании линейной зависимостимежду исходной концентрацией ДНК-мишени в исследуемом образце и цикломначала экспоненциального увеличения флуоресцентного сигнала.
Результатыинтерпретировались автоматически с помощью программного обеспечения исчитались положительными при наличии ДНК микроорганизма, если по каналууровеньфлуоресцентногосигналависследуемыхобразцахбылвышеустановленного порога флуоресценции, а в пробирке с внутренним контрольнымобразцом не превышал данный порог, при этом в таблице отображалось значениепорогового цикла амплификации.Данный метод позволял определить концентрацию условно-патогенныхмикроорганизмов, которая измерялась в геномных эквивалентах на миллилитрбиоматериала, помещенного в транспортную среду (сокращенно - ГЭ/мл).47Геномный эквивалент - это «объем» генетического материала, соответствующийодному геному бактерии, гриба.
Единицей измерения концентрации ДНК M.genitalium являлось количество копий ДНК возбудителя в 1 мл биологическогообразца.Важным для правильной диагностики инфекций, передаваемых половымпутем и условно-патогенной микробиоты урогенитального тракта, являетсяпоследовательность и техника забора клинического материала.
Учитывая, чтоMycoplasmagenitaliumцилиндрическогоимеетэпителия,высокуюуделялосьспецифичностьвниманиевзаборуотношенииотделяемогоцервикального канала и уретры.Забор материала из цервикального канала осуществлялся после удаленияслизи и отделяемого влагалища с эктоцервикса стерильным марлевым тампоном.Вводили рабочую часть зонда в цервикальный канал, делали два-три полныхоборота по часовой стрелке и извлекали, не прикасаясь к стенкам влагалища.Опускали рабочую часть зонда в эппендорф объемом 1,5 мл с 0,5 мл специальнойтранспортной среды с муколитиком и обламывали, оставив зонд в пробирке.Для получения соскоба из уретры пациентке рекомендовалось воздержатьсяот мочеиспускания не менее 1,5-2 часов.
Наружное отверстие обрабатывалитампоном с физиологическим раствором. При отсутствии выделений проводилимассаж уретры пальцем со стороны влагалища, прижимая ее к лобковой кости ивводили зонд на глубину 1-1,5 см, извлекали и прикладывали к чистомупредметному стеклу, передвигая зонд по нему легким нажатием.При получении материала из влагалища рабочей частью зонда-тампонавращательным движением проводили по поверхности боковых стенок влагалища,максимально полно собирая отделяемое, в том числе из заднебоковых сводов ипереносили в пробирку с транспортной средой. Пробирку плотно закрываликрышкой и маркировали.Перед проведением процедуры экстракции нуклеиновых кислот осаждаликаплиматериаласостенокпробиркиивнутреннейчастикрышкицентрифугированием (1500–3000 об/мин в течение 5 секунд), после чего48аккуратноперемешивалисодержимоепробиркинавортексе,избегаяразбрызгивания и попадания материала на внутреннюю часть крышки.2.2.4 Статистические методы исследованияПолученные данные обрабатывали методами вариационной статистики сиспользованием пакетов прикладных программ «Statistica for Windows 6.0» и«SPSS for Windows 21.0».
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
