Диссертация (1140384), страница 16
Текст из файла (страница 16)
В-четвертых, дляполногопониманиямеханизмовнечувствительностиP.aeruginosaккарбапенемам, необходимо комплексное исследование, в обязательном порядкевключающее оценку состояния OprD-поринов.105Глава 5. Роль эффлюкс-систем в формировании нечувствительностиPseudomonas aeruginosa к антибиотикам группы карбапенемов5.1. Введение к главеЭффлюкс-система(илиэффлюкс-насос,илиэффлюкс-помпа)бактериальной клетки – это сложно организованный молекулярный комплекс,обеспечивающий активное выведение антибактериальных препаратов и другихтоксичных для микробной клетки веществ из внутриклеточного пространстваво внешнюю среду.Гиперактивность эффлюкс-системы является клинически значимой – онаможет приводить к увеличению МПК карбапенемов до достаточно высокихзначений (64 – 128 мкг/мл) [58].
Распространенность штаммов с эффлюксопосредованной резистентностью среди карбапенемрезистентных изолятовварьирует от 20 до 60% [55, 199, 223].Целью данного раздела исследования является определение вкладаэффлюкс-системы в формирование нечувствительности к карбапенемам у P.aeruginosa.5.2. Материалы и методы, использованные для оценки роли эффлюкс-системы вформировании нечувствительности Pseudomonas aeruginosa к карбапенемамДля оценки структуры и функции MexAB-OprM используют протеомные,генетические и фенотипические методы.Наличие или отсутствие у исследуемого штамма экспрессии белковсистемы MexAB-OprM определяют с помощью PAGE-электрофореза ииммуноблоттинга.ДляпроведенияPAGE-электрофорезаосуществляютэкстракцию белков наружной мембраны и их разделение в полиакриламидномгеле.Затемпроводятреакциюиммуноблоттингасоспецифическими106антителами.
При этом в качестве маркера экспрессии выбирают только один избелков системы (MexA, MexB или OprM) [148, 216]. Идентификация белковMexAB-OprM P. aeruginosa с помощью масс-спектрометрии не проводилась,однако данная технология широко используется для детекции эффлюкс-систему других бактерий [93, 248].Активность экспрессии генов, кодирующих белки эффлюкс-системыMexAB-OprM, исследуют методом ПЦР с обратной транскрипцией, нарушениягенетической структуры выявляют с помощью секвенирования генов белковMexAB-OprMисравнениягенетическихпоследовательностейспоследовательностями генов контрольного штамма [188].Функционирование эффлюкс-системы можно оценить двумя способами.Первый способ предполагает использование ингибитора эффлюксной системы— EPI (от англ.
«efflux pump inhibitor» – ингибитор эффлюксной помпы).Второй способ детектирует перемещение системой какого-либо субстрата.Тесты с использованием EPI заключаются в определении наличия илиотсутствия синергизма ингибитора эффлюкс-системы с антибактериальнымпрепаратом.Наличиеактивногоэффлюксаподтверждаетсявслучаеуменьшения МПК антибиотика в присутствии ингибитора.
EPI описаны длямногих видов микроорганизмов [225]. Наиболее общим игибитором эффлюкссистем семейства RND считается ингибитор протонных каналов карбонилцианид-3-хлорфенилгидразон-СССР(отангл.«сarbonylсyanide3-сhlorophenylhydrazone»). Его влияние на изменение МПК антибактериальныхпрепаратов исследовалось у A. baumannii и P.
aeruginosa [22, 30]. Реже дляинактивации эффлюкс-систем P. aeruginosa используют пептидомиметикфенилаланин аргинил β-нафтиламид — PaβN (от англ. «phenylalanine arginyl βnaphthylamide») [32].Принцип определения активности эффлюксной системы с помощьюдетекции перемещения субстрата заключается в инкубации микроорганизма ссубстратом и последующем измерении его концентрации внутри и вне107бактериальной клетки. Существует несколько вариантов данного теста,отличающихся веществом-субстратом и способом измерения его концентрации.Дляизмеренияконцентрациивысокоэффективнуюприменяютжидкостнуюхромато-масс-спектрометрию,хроматографиюилидетекциюфлуоресценции [74].
В случае выбора последнего способа измеренияконцентрации необходимой характеристикой субстрата является способность кфлуоресценции. Например, бромистый этидий флуоресцирует только вкомплексе с молекулой ДНК. При активном эффлюксе он будет выбрасыватьсяиз клетки и, следовательно, уровень флуоресценции будет снижаться [156]. Вкачествесубстратовиспользуютантибиотикигруппыфторхинолонов,обладающие естественной флуоресценцией.
Описаны случаи использованиявеществ, уровень флуоресценции которых увеличивается или снижается привзаимодействии с компонентами или ферментами бактериальной клетки [41,144, 160, 196, 234]. Например, 1-анилинонафталин-8-сульфонат флуоресцируетприконтактесгидрофобнымиструктурамибактериальнойклетки.Динафтиламин начинает флуоресцировать при взаимодействии с липиднымбислоем. Краситель Хехст флуоресцирует при образовании комплексов смолекулами ДНК, резазурин - при окислении под действием оксидоредуктазы.Уровень флуоресценции таких веществ, как доксорубицин и пиронин Y,напротив, снижается при связывании с внутриклеточными структурами [144,166].Внастоящемисследованииоценкаэффлюкс-системизолятовP.aeruginosa проводилась с помощью протонного ингибитора RND эффлюкспомп CCCP [30].
При анализе результатов проводили сравнение активностиэффлюкс-системы с уровнями МПК меропенема и имипенема, а также сналичием альтернативных механизмов резистентности.Объектом исследования были 60 штаммов P. aeruginosa. Штаммыотбирали из коллекции лаборатории микробиологии ФГАУ «НМИЦ здоровьядетей» в соответствии с критериями, описанными выше (см. главу «Материалы108и методы исследования»). МПК меропенема и имипенема определяли припомощи метода серийных разведений (см. главу «Материалы и методыисследования»). Процедуры выявления альтернативных (бета-лактамазных ипорин-зависимых) механизмов резистентности описаны в Главах 3 и 4,соответственно.В 96-луночных планшетах с круглым дном делали двукратные разведениямеропенема (Sigma-Aldrich, США) в бульоне Мюллера-Хинтона (Bio-Rad,США).
В лунки планшета вносили инокуляты тестируемых штаммов (суспензиябактериальных клеток в бульоне Мюллера-Хинтона с мутностью 0,5 единиц пошкале МакФарланда): опытный инокулят (с добавлением CCCP) и контрольныйинокулят (с добавлением эквивалентного объема диметилсульфоксида растворителя для CCCP). Конечная концентрация CCCP в опытных лункахсоставляла 25 мкг/мл, конечные концентрации меропенема в опытных иконтрольных лунках - от 1 до 1024 мкг/мл.Планшеты инкубировали при 37°С, результаты учитывали через 24 часа.Сравнивали концентрацию отсутствия роста (КОР) в контрольных и опытныхрядах. Оценку активности эффлюкс-помп проводили согласно известнымрекомендациям [22].
Считали, что штамм демонстрирует значимую дляформирования устойчивости активность эффлюкса (гиперактивность) в техслучаях, когда наблюдалось уменьшение КОР в присутствии СССР в 4 и болеераз по сравнению с контрольными пробами без СССР.5.3. Результаты и обсуждениеПримеррезультатоввыявлениегиперактивностиэффлюкс-системыпоказан на рис.
14.Гиперактивность эффлюкса была выявлена у 28 из 51 (55%) карба-НЧизолятов. Кратность уменьшения КОР, равную 4, демонстрировали 16 из 28изолятов (57%) с гиперактивностью эффлюкса, у 6/28 (21%) изолятов данный109показатель был равен 16, у 3 (3/28, 11%) изолятов – кратность уменьшения КОРбыла равна 8.Рисунок 14.
Пример результатов выявление гиперактивности эффлюкс-системыдля штаммов P. aeruginosaПримечание. Лунки планшета 1 – 11 – разведения меропенема в диапазонеконцентраций от 1 до 1024 мкг/мл, лунка 1 – максимальная концентрация (1024мкг/мл), лунка 11 – минимальная концентрация (1 мкг/мл), лунка 12 – контроль ростатестируемого штамма (без антибиотика); исследуемые штаммы расположены в рядахпланшета A – H: ряд A - P. aeruginosa 46-604 (контроль), КОР = 512 мкг/мл, ряд B - P.aeruginosa 46-604 (опыт), КОР = 64 мкг/мл; ряд С - P. aeruginosa 36-989 (контроль),КОР = 16 мкг/мл, ряд D - P. aeruginosa 36-989 (опыт), КОР = 16 мкг/мл; ряд E - P.aeruginosa 46-818 (контроль), КОР = 32 мкг/мл, ряд F - P.
aeruginosa 46-818 (опыт),КОР = 16 мкг/мл; ряд G - P. aeruginosa 36-1758 (контроль), КОР = 256 мкг/мл, ряд H P. aeruginosa 36-1758 (опыт), КОР = 16 мкг/мл.Три остальных штамма имели кратность уменьшения КОР, равную 32, 64 и 128(таб. 12).110Таблица 12Значение гиперактивности эффлюкс-системы в формированиинечувствительности к карбапенемам у P. aeruginosaШтаммы с гиперактивностью эффлюксаМПКМПККратностьГиперГруппа Номермеропенема, имипенема, уменьшения активностьштаммов штаммамкг/млмкг/млКОРэффлюкса46-161184128+46-81452-16236-175846-197646-203248-162649-43649-4674161616161632323216323232832166432161616161616++++++++46-604888+Наличие другихмеханизмоврезистентностиoprD-инактивацияГиперпродукцияЦФ, oprDинактивацияoprD-инактивацияoprD-инактивацияoprD-инактивацияoprD-инактивацияoprD-инактивацияoprD-инактивацияoprD-инактивацияГиперпродукцияЦФ, oprDинактивацияГиперпродукцияЦФ, oprDинактивацияКП, oprDинактивацияКП, oprDинактивацияГиперпродукцияЦФ, oprDинактивация49-62164168+68-1582562568+29-5282565124+36-17475121284+36-21703284+39-3812565124+39-6482565124+oprD-инактивацияКП, oprDинактивацияКП, oprDинактивация46-259846-30646-312243288162444+++oprD-инактивацияoprD-инактивацияГиперпродукция ЦФ111Продолжение таблицы 12Штаммы без гиперактивности эффлюксаМПКМПККратностьГиперГруппа Номермеропенема, имипенема, уменьшения активностьштаммов штаммамкг/млмкг/млКОРэффлюкса46-312646-346325681281644++46-732641284+48-122348-155825645121644++49-4421285124+49-453128644+52-3482414+29-5722562562-36-10712561281-36-31852561282-36-98946-1510168321612-46-16192561281-46-20681281282-46-31095122562-Наличие другихмеханизмоврезистентностиГиперпродукцияЦФ, oprDинактивацияoprD-инактивацияКП, oprDинактивацияКП, oprDинактивацияoprD-инактивацияКП, oprDинактивацияГиперпродукцияЦФ, oprDинактивацияГиперпродукцияЦФ, oprDинактивацияКП, oprDинактивацияГиперпродукцияЦФ, oprDинактивацияГиперпродукцияЦФ, oprDинактивацияГиперпродукцияЦФ, oprDинактивацияoprD-инактивацияГиперпродукцияЦФ, oprDинактивацияКПГиперпродукцияЦФ, oprDинактивация112Продолжение таблицы 12Штаммы без гиперактивности эффлюксаМПКМПККратностьГиперГруппа Номермеропенема, имипенема, уменьшения активностьштаммов штаммамкг/млмкг/млКОРэффлюкса46-3646-66546-81848-123148-129948-1330512168848512161616162112221-48-204948-23742568256822-49-1185125122-49-3155125122-49-550128642-56-8838162-57-2132562562-58-3485125122-58-38165125122-Чувствительные изоляты12020,51142-173911144-11890,50,25144-90620,5146-20270,50,5146-249112148-7570,250,251ATCC2785311166-89111Примечание: КП – карбапенемаза, ЦФ – цефалоспориназы.-Наличие другихмеханизмоврезистентностиКП, oprDинактивацияoprD-инактивацияoprD-инактивацияoprD-инактивацияoprD-инактивацияoprD-инактивацияГиперпродукцияЦФ, oprDинактивацияoprD-инактивацияКП, oprDинактивацияКП, oprDинактивацияГиперпродукцияЦФ, oprDинактивацияoprD-инактивацияКП, oprDинактивацияКП, oprDинактивацияКП, oprDинактивацияНе обнаруженоНе обнаруженоНе обнаруженоНе обнаруженоНе обнаруженоНе обнаруженоНе обнаруженоНе обнаруженоНе обнаружено113У 23/51 (45%) карба-НЧ изолятов и у всех карба-Ч штаммов не быловыявлено гиперактивности эффлюкса.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
