Диссертация (1140384), страница 14
Текст из файла (страница 14)
aeruginosa были описаны выше (см.Главу 3).В результате проведенного электрофореза ампликонов гена oprD исравнения полученных ампликонов с референсными маркерами длин ДНК былоустановлено, что 47/60 (78,3%) ампликонов имели размеры порядка 1300 п. н.(нормальный ген имеет длину 1332 п.
н.). У 13/60 (21,7%) полученныхампликонов размеры значительно превышали норму, имея длину более 2000 п.н. (рис. 12).В результате секвенирования ампликонов были получены данные опоследовательностях нуклеотидов в генах oprD у 60 исследуемых штаммов.Было обнаружено два типа повреждений генетической структуры. К первойгруппе (тип 1) были отнесены изоляты с заменами аминокислот в oprD.
Ковторой группе (тип 2) – изоляты с мутациями, ведущими к обрыву синтезаOprD (преждевременным стоп-кодоном, сдвигом рамки считывания вследствиеделеции или инсерции нуклеотидов, а также изоляты с IS-элементом в генеoprD).901 2 3 4 5 6 7 8Ампликоныгена oprDРисунок 12. Пример электрофореза продуктов амплификации гена oprDПримечание. 1 – 4 – «удлиненные» ампликоны oprD (> 2000 п. н.); 5 – ампликон oprD нормальнойдлины контрольного штамма P. aeruginosa ATCC 27853 (порядка 1300 п. н.); 6 – отрицательныйконтроль амплификации (проба без ДНК); 7 – 8 – маркеры длин ДНК.Число изолятов в первой группе составило 16/60 (27%), из них у четырехизолятов выявлена замена одной аминокислоты, у 12 – замены двух и болееаминокислот.
Во второй группе число изолятов составило 44/60 (73%), при этомпреждевременный стоп-кодон обнаружен у 16/44 (36%) изолятов, сдвиг рамкисчитывания вследствие делеции или инсерции нуклеотидов – у 15/44 (34%)изолятов, повреждение oprD IS-элементом – у 13/44 (30%) изолятов. Всегообнаружено 24 вида повреждений гена второго типа, в том числе 7разновидностей стоп-кодонов, 5 разновидностей инсерций, 7 разновидностейделеций и 5 разновидностей IS-элементов (таб. 10). IS-элементы ISPa195,ISPsme1 и ISPst2 были обнаружены у P. aeruginosa впервые.
ISPa195 не имелгомологиисописаннымивставочнымипоследовательностямиибылзарегистрирован в базе данных GenBank под номером MF770250, депонированвбазахданныхBioProjecthttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/436637)и(режимIS-finder(режимдоступа:доступа:https://isfinder.biotoul.fr/scripts/ficheIS.php?name=ISPa195). Уровень показателяэкспрессии oprD у карба-Ч штаммов колебался от 0,6 до 1,3 (Ме = 1,0 (0,8; 1,2)),поэтому в качестве нижней границы нормального уровня экспрессии гена быловыбрано значение 0,8.Таблица 10ATCC27853МПКимипенема,мкг/млТипНомерoprD штаммаМПКмеропенема,мкг/млЗначение типа структуры гена oprD в формировании карбапенемнечувствительности у P.
aeruginosa11ПоказательэкспрессииНаличие другихмеханизмоврезистентностиНет нарушенийНет нарушений1Не обнаружено120266-8946-249144-90646-31220,511281120,52Не обнаруженоНе обнаруженоНе обнаруженоНе обнаруженоГиперэффлюкс,гиперпродукцияЦФ46-25984844-11890,50,2542-173912Замена однойаминокислотыD52NЗамены несколькихаминокислотD52N, G183D0,800,600,911,201,10D52N, R154C0,64ГиперэффлюксN43D, D52N, V127L, E185Q, P186G,V189T, S267A, T276A, G310E, A315G,L347M, L359V, S401A, Q422E0,96Не обнаружено1,30Не обнаружено911бЗамены аминокислот¹ и мутации,ведущие к обрыву синтеза OprDЗамены аминокислот11aКлассификация потипу oprDПродолжение таблицы 10Замены аминокислот¹ и мутации,ведущие к обрыву синтеза OprDПоказательэкспрессииНаличие другихмеханизмоврезистентности0Гиперэффлюкс36-217032846-814432D52N, E57S, R59S, T103S, K115T, F170L,Q202E, A210I, K230E, T240S, T262N,S267A, G281A, Q296K, E301Q, G310R,L359V, 372(VDSSSS-YAGL)383 ²0,40Гиперэффлюкс,гиперпродукцияЦФ46-20270,50,5N43D, D52N, , R59S, T103S, K115T,F170L, Q202E, A210I, K230E, T240S,T262N, S267A, G281A, Q296K, E301Q,G310R, L359V, 372(VDSSSS-YAGL)3831,25Не обнаружено49-6216416N43D, D52N, E57S, R59S, F148C,A149G, A150T, Q202E, A210I, K230E,T240S, T262N, S267A, G281A, Q296K,E301Q, G310R, L359V, 372(VDSSSSYAGL)3830,08Гиперэффлюкс,гиперпродукцияЦФЗамены несколькихаминокислотN43D, D52N, V127L, E185Q, P186G,V189T, S267A, T276A, G310E, A315G,L347M, L359V, S401A, Q422E, L432P92МПКимипенема,мкг/мл1бКлассификация потипу oprDМПКмеропенема,мкг/млТипНомерoprD штаммаПродолжение таблицы 10МПКимипенема,мкг/мл1бМПКмеропенема,мкг/млТипНомерoprD штамма48-7570,250,2546-206812812846-73264128Замены несколькихаминокислотПоказательэкспрессииНаличие другихмеханизмоврезистентностиN43D, D52N, E57S, R59S, T103S, K115T,F170L, E185Q, P186G, V189T, Q202E,A210I, K230E, T240S, T262N, S267A,G281A, Q296K, E301Q, G310E, A315G,L359V, 372(VDSSSS-YAGL)383, G423A1,15Не обнаружено1,29КП0Гиперэффлюкс,КП49-5501286446-346348-162658-381646-19768165121616851232Преждевременныйстоп-кодон (TAG)вследствие заменынуклеотидовНепоказано³Не показаноНе показаноНе показаноНе показаноГиперпродукцияЦФГиперэффлюксГиперэффлюксКПГиперэффлюксnt 375,376CC→AGnt 629G→Tnt 962C→Tnt 1092G→Ant 1094C→T93Замены аминокислот¹ и мутации,ведущие к обрыву синтеза OprDМутации, ведущие кобрыву синтеза OprD22aКлассификация потипу oprDПродолжение таблицы 10ПоказательэкспрессииНаличие другихмеханизмоврезистентностиnt 1094C→TНе показаноНе показаноНе показаноНе показаноГиперэффлюксГиперэффлюксКПГиперэффлюкс,гиперпродукция ЦФГиперпродукция ЦФГиперпродукция ЦФГиперэффлюкс,гиперпродукция ЦФГиперэффлюкс,гиперпродукция ЦФГиперпродукция ЦФГиперпродукция ЦФГиперпродукция ЦФКПКПКПГиперэффлюкс,гиперпродукция ЦФГиперэффлюкс46-203249-43649-11836-17471632512512323251212836-107146-310946-3126256256256128256128Не показаноНе показаноНе показано52-348241Не показано48-204936-318546-161946-3658-34849-31549-45325625625651251251212825612812851251251264Не показаноНе показаноНе показаноНе показаноНе показаноНе показаноНе показано52-1621616Преждевременныйстоп-кодон (TAG)вследствие заменынуклеотидовСдвиг рамкисчитываниявследствие инсерцииили делециинуклеотидовnt 1274C→Tnt 1321G→Ant 308Ant 309nt 492Gnt 493Не показано942бЗамены аминокислот¹ и мутации,ведущие к обрыву синтеза OprDМПКимипенема,мкг/мл2aКлассификация потипу oprDМПКмеропенема,мкг/млТипНомерoprD штаммаПродолжение таблицы 10Замены аминокислот¹ и мутации,ведущие к обрыву синтеза OprDПоказательэкспрессииНаличие другихмеханизмоврезистентности2б48-155857-21346-30668-15848-122346-161148-133029-57236-175849-4674256322562568825616161625616256512422563216Сдвиг рамкисчитываниявследствие инсерцииили делециинуклеотидовnt 646Gnt 647nt 711Gnt 712nt 1275Cnt 1276nt 131,132ΔCAnt 400ΔGnt 584-nt620Δ37 п.
н.nt 602-nt612Δ11 п. н.nt 619,620ΔCGnt 786ΔAnt 1377ΔTНе показаноНе показаноНе показаноНе показаноНе показаноНе показаноНе показаноНе показаноНе показаноНе показаноГиперэффлюксКПГиперэффлюксГиперэффлюкс, КПГиперэффлюкс, КПГиперэффлюксНе обнаруженоКПГиперэффлюксГиперэффлюкс2в29-528256512IS-элементыISPsme1Не показаноГиперэффлюкс, КП39-38139-64849-44246-1510256256128851251251216ISPa1328Не показаноНе показаноНе показаноНе показаноГиперэффлюкс, КПГиперэффлюкс, КПГиперэффлюкс, КПНе обнаружено48-123146-81846-66556-8838816816161616Не показаноНе показаноНе показаноНе показаноНе обнаруженоНе обнаруженоНе обнаруженоНе обнаружено95МПКимипенема,мкг/млКлассификация потипу oprDМПКмеропенема,мкг/млТипНомерoprD штаммаПродолжение таблицы 10МПКимипенема,мкг/мл48-129936-98946-60441681632848-2374Примечание:882вКлассификация потипу oprDIS-элементыЗамены аминокислот¹ и мутации,ведущие к обрыву синтеза OprDПоказательэкспрессииНаличие другихмеханизмоврезистентностиISPa1328ISPa195ISPa26Не показаноНе показаноНе показаноISPst2Не показаноНе обнаруженоГиперпродукция ЦФГиперэффлюкс,гиперпродукция ЦФНе обнаружено¹ - Подстрочным шрифтом выделены позиции аминокислот, слева от позиции указана аминокислота референсного штамма, справа –аминокилота исследуемого штамма;² - дивергентная последовательность 10 аминокислот [74];³ - оценка экспрессии oprD не проводилась, так как выявлены мутации, ведущие к обрыву синтеза поринаОбозначения аминокислот: «G» - глицин; «A» - аланин, «V» - валин, «L» - лейцин, «I» - изолейцин, «P» - пролин, «F» - фенилаланин,«Y»- тирозин, «W» - триптофан, «S» - серин, «T» - треонин, «D» - аспарагиновая кислота, «Е» - глутаминовая кислота, «N» - аспарагин, «Q» глутамин, «С» - цистеин, «М» - метионин, «Н» - гистидин, «К» - лизин, «R» - аргинин; «nt» – позиции нуклеотидов; «→» - заменынуклеотидов; «Δ» - делеция нуклеотидов; «п.
н.» - пара нуклеотидов; обозначения нуклеотидов: «A» - аденин, «T» - тимин, «G» - гуанин,«C» - цитозин; ЦФ - цефалоспориназы; КП - карбапенемазы.96МПКмеропенема,мкг/млТипНомерoprD штамма97В группе изолятов без мутаций, ведущих к обрыву синтеза OprD (изолятыпервой группы – 16 штаммов), показатель экспрессии варьировал в диапазонеот 0 до 1,3 (Me = 0,9 (0,6; 1,2)) (таб. 10). В целом, между показателямиэкспрессии у карба-Ч изолятов из первой группы и показателями экспрессии укарба-НЧ изолятов из той же группы не было выявлено статистическизначимых различий (р > 0,05) (рис. 13). Если говорить более детально, то вгруппе изолятов без мутаций, ведущих к обрыву синтеза OprD, среди карба-НЧизолятов (7/16) уровень экспрессии был снижен у 5 изолятов. Все они обладалидополнительными механизмами устойчивости к карбапенемам.Все изоляты, чувствительные к меропенему и имипенему, попали вгруппу без мутаций, ведущих к обрыву синтеза OprD.
У 4 из 9 чувствительныхизолятов присутствовала замена лишь одной аминокислоты в гене oprD, уостальных пяти изолятов обнаружены замены нескольких аминокислот. КарбаНЧ изоляты распределились по разным группам: у 16/51 (31%) изолятов найденпреждевременныйстоп-кодон,у13/51(25%)изолятовобнаруженоповреждение oprD вставочными элементами (ISPsme1, ISPa1328, ISPa195,ISPa26, ISPst2), у 7/51 (14%) изолятов найдены замены нескольких аминокислотв oprD (при этом пониженный уровень экспрессии гена обнаружен только у 5из них), у 7/51 (14%) изолятов – сдвиг рамки считывания вследствие делециинуклеотидов, и у 8/51 (16%) – сдвиг рамки считывания вследствие инсерциинуклеотидов.Мутации, ведущие к обрыву синтеза OprD, были найдены у 44/51 (86%)карба-НЧизолятов.82%изних(36/44)обладалидополнительнымимеханизмами нечувствительности к карбапенемам.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
