Диссертация (1140276), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Микроскопическое изучение гистологических срезовпроводили на микроскопе Leiсa DMRXA (Германия). Морфометрическоеисследование площади ишемического очага в головном мозге проводили приувеличении х200 с помощью планиметрической линейки, результат выражали вмкм2. Морфометрические исследования проводили с помощью компьютернойпрограммы анализа изображений Image Scope M (Россия, Москва).Оценку экспрессии фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) в тканиголовного мозга проводили иммуногистохимическим методом с использованиемнабора первичных специфических для крыс антител к VEGF (клон SP 28, типRabbit, SpringBio) и высокоадгезивные стекла с положительно заряженнойповерхностью (SuperFrostPlus).
Срезы высушивали в течение 12 часов притемпературе 37оС на термостолике. Все этапы иммуногистохимической реакциипроводились в автоматическом режиме на иммуногистостейнере BenchMarkXT(Ventana, USA) с соблюдением протокола исследования. Для визуализацииприменяли универсальную систему UltraVIEWUniversalDAB (Ventana, USA) –комплекс с вторичными антителами и хромоген DAB. Докрашивание препаратовпроводили Hematoxylin 2 (Ventana, USA).После проведения реакции срезыподвергали дегидратации и помещали под покровное стекло.
Подсчитывали приувеличении х400 количество клеток с цитоплазматической экспрессией VEGF от47светло- до темно-коричневого окрашивания на условной единице площади тканимозга в 10 случайно отобранных полях зрения.2.2.7 Статистические методы исследованияСтатистическаяобработкарезультатовисследованияпроводиласьспомощью пакета прикладных программ IBM SPSS Statistics 19. Показателиобрабатывались методами описательной статистики и представлены в видемедианы (Ме) и квартилей [Q1-Q3]. Значимость различий между группамиживотных оценивали при помощи непараметрического критерия Крускалла–Уолиса. Для сравнения двух независимых групп по одному количественномупризнаку использовали непараметрический критерий Манна–Уитни.
Анализдинамики изученных показателей в процессе лечения осуществляли с помощьюкритерия Фридмана (в случае более двух зависимых выборок) и парного критерияВилкоксона (в случае двух зависимых выборок). Если значение p было меньше0,001, то p указывали в формате p<0,001. Для выявления связи между изучаемымипараметрами использовали коэффициент корреляции Спирмена (R). Отличиясчитали статистически значимыми при р≤0,05.48ГЛАВА 3РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙИ ИХ ОБСУЖДЕНИЕ3.1 Морфофункциональные изменения приэкспериментальной ишемии коры головного мозгаПри экспериментальной фокальной ишемии головного мозга намипроведена оценка неврологического и этологического статуса, микроциркуляциив очаге ишемии коры головного мозга, количественного состава клеток в крови исопряженных гематологических показателей, концентрации ЭПО в сывороткекрови, а также морфологическая и морфометрическая оценка в ишемизированнойткани коры головного мозга с определением экспрессии в очаге ишемии антител кфактору роста сосудистого эндотелия (VEGF).3.1.1 Морфологическая верификация и экспрессия VEGFв очаге повреждения при экспериментальной ишемиикоры головного мозгаДля верификации поражений нервной ткани при выбранной модели ишемиикоры головного мозга у крыс, вызванной диатермокоагуляцией пиальных сосудовв области пре- и постцентральных извилин левого полушария головного мозга,использовалиморфологическиеметоды.Гистологическоеисследованиепрепаратов головного мозга животных (n=5) через 2 часа после моделированияишемии показало, что дистрофические и некротические изменения нервной тканизахватывали область коры головного мозга (рисунок 1А).При исследовании гистологических препаратов головного мозга в динамикеИКГМ на 7 сутки эксперимента в местах коагуляции пиальных сосудовопределялись некроз стенки сосудов, мелкоочаговые кровоизлияния и отек впериваскулярной и перицеллюлярной ткани (рисунок 1Б), регистрировались49дистрофия и некроз клеточных элементов.
Нейроциты теряли большую частьнабухших отростков, вытягивались, приобретая угловатую форму, глыбкихроматина в нейроцитах исчезали, цитоплазма их бледно окрашиваласьтионином, ядра клеток сморщивались, окрашивались тионином в темно-синийцвет. Отмечалось острое набухание и лизис клеточных элементов с образованиемклеток с признаками сморщивания и склероза (клеток-теней) (рисунки 2А, 2Б,2В).
Реакция нейроглии заключалась в утолщении, фрагментации и распадеастроцитов, набухании их тел и отростков и постепенном превращенииастроцитов в амебовидные клетки; определялись набухание и дистрофическиеизменения микроглии (рисунок 3А). Миелиновые волокна коры и белоговещества головного мозга находились в состоянии набухания и вакуолизациислоя миелина, а в нервных волокнах отмечалась фрагментация с последующимзернистым и глыбчатым распадом (рисунок 3Б).АБРисунок 1 – Морфологические изменения в очаге ишемическогоповреждения головного мозга: А – очаг некроза в коре головного мозга через2 часа после ИКГМ (окраска гематоксилином и эозином, ув.
х50);Б – некроз стенки сосудов, кровоизлияние, периваскулярный иперицеллюлярный отек в зоне коагуляции пиальных сосудов на 7 суткипосле ИКГМ (окраска гематоксилином и эозином, ув. х200)50АБВРисунок 2 – Морфологические изменения в очаге ишемическогоповреждения головного мозга на 7 сутки эксперимента:А – исчезновение глыбок хроматина в нейроцитах с бледноокрашеннойцитоплазмой (окраска тионином по Нисслю, ув.
х400); Б – сморщенные ядранейроцитов темно-синего цвета (окраска тионином по Нисслю, ув. х400);В – острое набухание и лизис клеточных элементов с образованием клетоктеней (окраска тионином по Нисслю, ув. х400)АБРисунок 3 – Морфологические изменения в очаге ишемическогоповреждения головного мозга на 7 сутки эксперимента:А – фрагментация и распад астроцитов с превращением в амебовидныеклетки (окраска гематоксилином и эозином, ув.
х400); Б – набухание ивакуолизация слоя миелина в нервных волокнах с их фрагментацией иглыбчатым распадом (окраска по Шпильмейеру, ув. х400)51Результаты микроскопического исследования гистологических препаратовголовного мозга на 14 сутки ИКГМ показали, что в зоне коагуляции пиальныхсосудов распространенность некроза и кровоизлияний несколько уменьшилась,здесьотмечаласьокружающейактивизациятканинекротическиемозгаизмененияглиальныхпо-прежнемувнейроцитах,макрофагов(рисунок4А).Вотмечалисьдистрофическиеиперицеллюлярногоиявленияпериваскулярного отека, встречались клетки-тени, амебовидные астроциты(рисунок 4Б), набухшие и вакуолизированные миелиновые волокна. На 30 суткипослеИКГМвместахкоагуляциипиальныхсосудовсформировалисьглиосоединительнотканные рубцы (рисунок 4В).АБВРисунок 4 – морфологические изменения в очаге ишемическогоповреждения головного мозга: А – некроз и кровоизлияния в мозговомвеществе, глиальные макрофаги в зоне коагуляции пиальных сосудов на 14сутки после ИКГМ (окраска гематоксилином и эозином, ув.
х200);Б – дистрофия и некроз нейроцитов, клетки-тени, амебовидные астроциты,перицеллюлярный отек на 14 сутки после ИКГМ (окраска гематоксилином иэозином, ув. х400); В – сформированный глиосоединительнотканный рубецна 30 сутки после ИКГМ (окраска гематоксилином и эозином, ув. х400)Результаты количественного исследования гистологических препаратовголовного мозга представлены в таблице 2. Количество интактных нейронов наусловной единице площади (1 мм2) достоверно снижалось на 3, 7, 14 и 30 суткиТаблица 2Морфометрические показатели в очаге повреждения при экспериментальной ИКГМ (Me [Q1-Q3])ПоказателиИН,ед./мм2НХр,ед./мм23 суткиГруппа 2.Группа 1.ИКГМЛ/опериров.(n=10)(n=10)190,53[189,67192,6]0КТ,ед./мм20Гл,ед./мм2136,93[130,43139,68]14,88[13,6516,07]0МС,ед./мм2ПИ,мкм240,47[37,2546,54] *36,44[31,9638,11]*56,74[51,6960,03] *123,55[115,20138,16]5,27[4,435,55] *557,13[541,38582,23]7 суткиГруппа 1.Группа 2.Л/опериров.ИКГМ(n=10)(n=10)190,92[189,23194,19]00137,79[132,34139,64]14,80[13,31-15,67]036,50[30,8742,77] *25,94[25,2126,73] *62,25[58,0866,84] *119,45[115,54125,13]7,13[6,417,87] *604,06[593,48625,80]14 суткиГруппа 1.Группа 2.Л/опериров.ИКГМ(n=10)(n=10)191,18[189,30194,13]00135,47[131,56140,59]15,54[14,08-16,70]030,38[23,0836,39] *34,10[32,0335,09] *70,75[67,0472,68] *133,53[130,48136,89]8,84[7,7310,14] *734,66[718,89744,00]30 суткиГруппа 1.Группа 2.Л/опериров.ИКГМ(n=10)(n=10)25,21[15,9632,29] *42,10[40,4543,10] *076,35[70,7778,01] *135,74120,03[117,96[133,36138,17]123,62]14,8814,26[14,16-15,54] [11,93-16,01]191,14[187,17194,44]00994,65[968,38995,85]Примечание: * – значимые (р<0,01) различия с группой 1; ИН – интактные нейроны, НХр – нейроны с хроматолизом,КТ – клетки-тени, Гл – глиоциты, МС – мелкие сосуды, ПИ – площадь инфаркта.53после ИКГМ по сравнению с группой ложнооперированных животных.
Вдинамике ИКГМ на 7 и 14 сутки на правах тенденции, а на 30 суткистатистически значимо (р<0,01) снижалось количество интактных нейронов посравнению с 3 сутками эксперимента. На 3, 7, 14 и 30 сутки после ИКГМ в очагеповреждения визуализировались нейроны с хроматолизом и клетки-тени, ихпредставительство на 7 и 14 сутки эксперимента снижалось по сравнению с 3сутками, а на 30 сутки эксперимента вновь увеличивалось по сравнению с 7сутками после ИКГМ. Количество глиоцитов в очаге ишемического поврежденияголовного мозга статистически значимо не изменялось на 3, 7, 14 и 30 сутки посравнению с группой ложнооперированных животных, а также в динамикеИКГМ.Значительные изменения зафиксированы в количестве мелких кровеносныхсосудов в очаге повреждения после моделирования ИКГМ: их представительствоснижалось на 3, 7, 14 сутки эксперимента и восстанавливалось до значений вгруппе ложнооперированных животных на 30 сутки эксперимента.
Площадьинфаркта в динамике ИКГМ увеличивалась на 7 сутки – на 8,4% по сравнению с 3сутками, на 14 сутки – на 31,8% (р<0,01) по сравнению с 3 сутками, на 30 сутки –на 78,5% (р<0,01) по сравнению с 3 сутками. Расширение зоны повреждения вдинамикеИКГМобеспечиваетсяширокимспектромпатогенетическихмеханизмов.Полагаем, что увеличение площади инфаркта на 3–7 сутки ИКГМобусловленонеспецифическими(снижениеэнергетическогообеспечения,повреждение мембран и ферментов, дисбаланс ионов и воды в клетках, изменениеэкспрессиимеханизмамигеновидизрегуляцияповреждениянейроновфункцийклеток)[37].Последниеиспецифическимивключаютзвенья«ишемического каскада» в области пенумбры («ишемической полутени»): вусловиях относительного, а затем абсолютного энергетического дефицитанейронов нарушается функция ионных АТФаз, утрачивается калий-натриевыйградиент, накапливается кальций в клетке, что сопряжено с гипергидратацией,снижением возбудимости, активацией глутаматных рецепторов NMDA.54На следующем этапе «ишемического каскада» ключевыми звеньямипатогенезавыступаютглутаматнаяэксайтотоксичность,прогрессирующеенакопление Са2+ в нейронах, активация кальмодулин-зависимых протеинкиназ,мембранныхфосфолипаз,эндонуклеаз,разобщениеокисленияифосфорилирования в митохондриях, накопление жирных кислот и повышениедетергентной активности цитозоля нейронов, активация свободнорадикальныхпроцессов, приводящие в совокупности к гибели нейронов путем апоптоза инекроза.На более поздних этапах после ИКГМ (14–30 сутки), когда в очагеповреждения увеличивается количество мелких сосудов, восстанавливаетсякровоток, ведущим механизмом расширения зоны инфаркта в рамках синдромацеребральнойишемии–реперфузиистановитсяоксидативныйстресс,аисточниками свободных радикалов выступают сами нейроны (нейрональная NOсинтаза), глиоциты, а позднее – нейтрофилы крови, поступающие в очаг вусловияхповышеннойпроницаемостигематоэнцефалическогобарьера,поврежденного свободными радикалами, цитокинами, медиаторами воспаления.Повышение ГЭБ обеспечивает воздействие на нервную ткань накопившегося впериод ишемии широкого спектра цитотоксических веществ – продуктовметаболизма, ионов, ферментов и др.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
