Диссертация (1140276), страница 8
Текст из файла (страница 8)
ИКГМ + ЭПО4. ИКГМ + ЛИ5. ИКГМ + ЭПО + ЛИИтогоСхема введенияЭПО20040твердой мозговой оболочки, его расширяли до 7 мм в диаметре зажимом типа«москит». Рану зашивали непрерывным швом.Вторая группа представлена крысами, у которых моделировали фокальнуюишемию коры головного мозга (ИКГМ) по методике, описанной Chen S. T. [127,69]. После трепанации черепа, техника которой описана в первой группеживотных, вскрывали крестообразно твердую мозговую оболочку.
С помощьюбиполярного электрокоагулятора под бинокулярной лупой (х3,5, «ЛОМО»,Россия) для достижения полной перманентной фокальной ишемии производилидиатермокоагуляцию пиальных сосудов поверхности коры головного мозга попериметру трепанационного отверстия в области задних отделов левой лобнойдоли и передних отделов левой теменной доли головного мозга (прецентральныеи постцентральные извилины левого полушария головного мозга). Выбор областиИКГМ определялся тем, что задние отделы левой лобной доли и передние отделылевой теменной доли являются наиболее функционально значимыми дляреализации двигательной и чувствительной функций животных, а также тем, чтоисточникомкровоснабжениякорыголовногомозгавобластипре-ипостцентральных извилин являются преимущественно корковые ветви среднеймозговой артерии, которая чаще всего поражается при ишемических инсультахголовного мозга у людей.У третьей группы животных моделировали ИКГМ по методике, описаннойвыше у второй группы животных, и вводили внутрибрюшинно через 3, 24, 48часов после индукции ИКГМ рекомбинантный эритропоэтин («Эпокрин 2000МЕ», ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» ФМБА России, Санкт-Петербург) из расчета 5 000МЕ на 1 кг массы животного.
Суммарная доза введенного ЭПО составила 15 000МЕ/кг.У четвертой группы животных моделировали ИКГМ по методике,описанной выше у второй группы животных, и через 2 часа после индукцииИКГМ однократно воздействовали на область ишемического очага лазернымизлучением с длиной волны 970 нм. Для этого использовали лазерныйхирургический аппарат «ИРЭ-Полюс» (ООО НТО «ИРЭ-Полюс», Россия).41Облучение проводилось дистанционно с расстояния 2–3 см от поверхностиоперационного поля в непрерывном режиме мощностью 1 Вт в течение 2 минут.Доставка лазерного излучения производилась через моноволоконный световоддиаметром 0,6 мм с плоским торцом.У пятой группы животных моделировали ИКГМ по методике, описаннойвыше у второй группы животных, и через 2 часа после индукции ИКГМпроводили дистанционное накожное облучение диодным лазером, как описано вгруппе 4.
Через 3 часа после индукции ИКГМ (т. е. через час после воздействиялазером), через 24 и 48 часов животным внутрибрюшинно трехкратно вводилирекомбинантный эритропоэтин в суммарной дозе 15 000 МЕ/кг, как описано вгруппе 3.2.2 Методы исследования2.2.1 Оценка неврологического статуса животныхДля оценки неврологического статуса при экспериментальной ИКГМиспользовали шкалу Garcia J. H. [150]. Данный тест позволяет оцениватьследующие параметры, характеризующие поведенческую активность животных,двигательнуюфункцию,чувствительнуюфункцию,стато-координаторнуюфункцию.1. Спонтанная активность. Животное наблюдали в течение 5 минут вусловиях его нахождения в клетке.
Активность крысы оценивали по способностиприближаться ко всем четырем бортам клетки. Критерии оценки: 3 балла –животное свободно перемещалось, исследовало окружающее пространство иприближалось как минимум к трем бортам клетки; 2 балла – крыса перемещаласьпо клетке, не могла приближаться ко всем бортам клетки, но достигала хотя быодного из них, движения неуверенные; 1 балл – значительныепоражения вдвигательной сфере: крыса не могла подняться, приближаться к бортам клетки,42незначительно перемещалась в горизонтальном положении; 0 баллов – животноене двигалось.2. Симметричность в движении всех конечностей. Животное держали вподвешенном состоянии за хвост для оценки симметрии в движении конечностей.Критерии оценки: 3 балла – все 4 конечности растянуты симметрично; 2 балла –конечности на правой стороне удлинялись в меньшей степени или медленнее, чемна левой; 1 балл – минимальные движения в правых конечностях; 0 баллов –отсутствие движений в правой передней конечности.
Оценивались движения вправых конечностях, так как при поражении левого полушария головного мозга(левой лобной доли и передних отделов левой теменной доли) отмечаются егопризнаки на контрлатеральной (правой) стороне.3. Симметричность в движениях передних конечностей при движениивперед.
Держа за хвост, животное помещали к поверхности стола и ставили напередние лапы. Симметричность при движении вперед на обеих переднихконечностях оценивалась, когда крыса передними конечностями достигалаповерхности стола, а задние конечности удерживались в воздухе. Критерииоценки: 3 балла – обе передние лапы вытянуты и крыса идет симметрично напередних конечностях; 2 балла – праваяпередняя конечность вытянута вменьшей степени, чем левая, что ведет к нарушению ходьбы на переднихконечностях; 1 балл – отмечаются минимальные движения в правой переднейконечности; 0 баллов – нет движений в правой передней конечности.4. Способность забираться по стенке клетки.
Крысу помещали к стенкепроволочной клетки. Обычно крыса использует все четыре конечности, чтобыподняться вверх по стенке проволочной клетки. При снятии крысы с проволочнойклетки за хвост крыса сопротивляется. Критерии оценки: 3 балла – крыса легкоподнимается по проволочной стенке и крепко закрепляется за прутья всемиконечностями; 2 балла – конечности на правой стороне ослаблены во времяподъема и не оказывают такого же сопротивления, как на левой стороне, приснятии животного с проволочной стенки; 1 балл – животное не может поднятьсяпо стенке или ходит по кругу вместо подъема по проволочной стенке.435. Оценка проприоцептивной чувствительности.
Определяется реакция наприкосновение тупой деревянной палочкой к каждой стороне туловища.Критерии оценки: 3 балла – приприкосновении палочки с обеих сторонтуловища животного крыса одинаково реагирует путем поворота головы всторону прикосновения; 2 балла – замедленная реакция крысы поворотом головына прикосновения с правой стороны по сравнению с левой; 1 балл – нет реакцииживотного на прикосновение с правой стороны.6. Ответ на прикосновение к вибриссам.
Тупой деревянной палочкойвоздействовали на вибриссы с каждой стороны. При этом палочка быларасположена сзади от вибриссов животного во избежание попадания в полезрения крысы. Критерии оценки: 3 балла – крыса одинаково реагировала нараздражитель с обеих сторон; 2 балла – замедленная реакция на раздражитель справой стороны; 1 балл – нет реакции на раздражитель с правой стороны.Для интегральной оценки неврологического статуса каждого животногоподсчитывали сумму всех шести оцениваемых параметров. Минимальноеколичество баллов по сумме признаков (3 балла) характеризуется каквыраженный неврологический дефицит, максимальное количество баллов (18баллов) свидетельствует об отсутствии неврологического дефицита.2.2.2 Оценка поведения животных в актографе «открытое поле»Проводится для оценки поведения животных в незнакомых условиях.
Методзаключается в исследовании двигательного компонента ориентировочной реакциии эмоциональной реактивности животных [81, 92].Актограф представляет собой квадратный манеж 80х80 см, дно которогоразбито на 16 квадратов. В центре каждого квадрата имеется отверстие диаметром3,8 см для выявления исследовательской активности у животных. Исследуемоеживотное помещали в актограф в угловой квадрат. Каждое животноетестировалось 1 раз.
Время наблюдения составляло 10 минут. Регистрировалиследующие показатели: количество переходов животных по 16 квадратам44рассматривалось как мера локомоции – горизонтальная активность (ГА), числоподъемов на задние лапы являлось критерием ориентировочной реакции –вертикальная активность (ВА), количество выглядываний через отверстиеотражало исследовательскую активность (ИА), число фекальных болюсов (ФБ)свидетельствовало о вегетативных последствиях эмоционального стресса,вызванного помещением животного в незнакомую обстановку, количество актовгруминга (ГР). Поведенческие и вегетативные реакции животных регистрировалис помощью цифровой видеокамеры HP HD 2300 (Китай).
Полученные данныеобрабатывали математически с использованием компьютерной программыRealTimer (ООО «НПК Открытая Наука», Россия).2.2.3 Оценка микроциркуляции в интактных и ишемизированныхтканях коры головного мозга методом лазернойдопплеровской флуориметрииОценка микроциркуляции у животных производилась на 3, 7, 14 и 30 суткиэкспериментасинфракрасногоиспользованиемлазерасмонтированногоизсприборапомощьюкварцевыхЛАКК-01(Россия)трехканальногомоноволоконныхнаосновесветовогозонда,световодов.Показателиснимались через трепанационное отверстие с помощью датчика, приложенного кместуоперации.Времязаписилазернойдопплеровскойфлуориграммысоставляло 5 минут.
Математическая и статистическая обработка показателейприбора осуществлялась с помощью комплекта программ ООО «Лазма» (Россия).Определяли показатель микроциркуляции (ПМ), которыйотусредненнойскоростиэритроцитов(Vср)являетсяифункциейконцентрацииэритроцитов в зондируемом объеме тканей (N эр), зависящей от показателягематокрита и количества функционирующих сосудов:Величинапоказателямикроциркуляцииперфузионных единицах (пф. ед.).измеряласьПМ = N эр + V ср.вотносительных452.2.4 Гематологические методы исследованияДля оценки гематологических показателей использовали автоматическийгематологический анализатор для ветеринарии ВС-2800 Vet (Mindray, Китай).Образец цельной крови подносился к пробозаборнику прибора для забора 13 мклкрови.
В анализаторе используются 2 независимых друг от друга принципаизмерения: 1) метод Couter для определения лейкоцитов, эритроцитов итромбоцитов; 2) колориметрический метод для определения гемоглобина.Оценивали следующие гематологические показатели:абсолютное количество лейкоцитов (WBC), ·109/л;абсолютное количество лимфоцитов, ·109/л;абсолютное количество гранулоцитов, ·109/л;абсолютное количество моноцитов, ·109/л;количество эритроцитов (RBC), ·1012/л;гемоглобин (HGB), г/л;гематокрит (НСТ), %;средний объем эритроцита (MCV), фл;среднее содержание гемоглобина в эритроците (МСН), пг;средняя концентрация гемоглобина в эритроците (МСНС), г/дл;количество тромбоцитов (PLT), ·109/л.2.2.5 Определение концентрации эритропоэтинаКонцентрацию эритропоэтина в сыворотке крови определяли с помощьюавтоматического иммуноферментного анализатора PersonalLAB (Италия) сприменением специфической тест-системы для крыс фирмы Cloud-Clone Corp(США).
Результаты выражали в пг/мл.462.2.6 Морфологические и иммуногистохимическиеметоды исследованияПосле выведения животных из эксперимента головной мозг извлекали ификсировали в 10% растворе нейтрального формалина. Серийные срезыголовного мозга окрашивали гематоксилином и эозином по методу М.Бильшовского, В. Шпильмейера для выявления миелиновых волокон, по методуФ. Ниссля – для определения тигроидного вещества Ниссля, глиальных клеток[15]. На условной единице площади среза подсчитывали при увеличении х400количествоинтактныхнейронов,количествоклеток-теней,количествоколичествонейроновглиоцитовисхроматолизом,количествомелкихкровеносных сосудов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
