Диссертация (1140149), страница 17
Текст из файла (страница 17)
п. 2.2.2.4).2.2.2.3. Морфологическое исследование.Полученные путем аспирационной биопсии на 7-10 и 18-24 дни менструального цикла образцы ткани эндометрия от 120 женщин с ХЭ заливались 10% нейтраль-69ным раствором формалина и доставлялись в лабораторию в стерильных контейнерах в течение 24 часов после забора.Группу морфологического контроля составили образцы эндометрия, залитыеранее в парафиновые блоки и нарезанные для текущего исследования на парафиновые срезы, от 30 женщин репродуктивного возраста, у которых пайпель-биопсияпроводилась при подозрении на гиперпластический процесс эндометрия.В лаборатории фиксированный в формалине материал заливали в парафин иготовили серийные парафиновые срезы толщиной 4-5 мкм в количестве не менее 22штук.
Срезы фиксировали на предметные полилизиновые стекла (Mainzel Glaser,Polylisine, Германия) и инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение12 часов. Далее срезы депарафинировали и регидратировали последовательно в ряде растворов, состоящем из 3 ксилолов, 2 абсолютных спиртов, 2 95% спиртов, 80%и 70% спирта и дистиллированной воды. По одному препарату от каждого случаяокрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике, после чего посредством световой микроскопии при 100-400-кратном увеличении изучали структурные особенности эндометрия у пациенток обеих групп.В процессе световой микроскопии особое внимание уделяли выявлению признаков ХЭ (наличие диффузной или чаще очаговой, расположенной вокруг желез икровеносных сосудов, лимфогистиоплазмоцитарной инфильтрации базального ифункционального слоев эндометрия, выявление в строме эндометрия даже единичных плазматических клеток, очаговое фиброзирование стромы эндометрия и склеротические изменения стенок спиральных артерий) и оценке морфологическихмаркеров рецептивности эндометрия (соответствие эндометрия фазе менструального цикла, развитие и степень зрелости пиноподий) в «окно имплантации» (СухихГ.Т., Шуршалина А.В., 2010).2.2.2.4.
Иммуногистохимическое исследование.Иммуногистохимическому исследованию были подвергнуты образцы ткани эндометрия, полученные от 120 женщин с ХЭ путем его пайпель-биопсии, произведенной в качестве самостоятельного исследования или в процессе выполненияофисной гистероскопии на 18-24 день менструального цикла. Доставленный в лабораторию в стерильных контейнерах с 10% раствором формалина в течение 24 часовпосле забора материал использовался для приготовления парафиновых срезов с по-70следующей их фиксацией на полилизиновых стеклах по методике, примененной приморфологическом исследовании эндометрия (см.
п. 2.2.2.3). В качестве контроля были исследованы парафиновые срезы от 30 здоровых женщин репродуктивного возраста, вошедшие в группу морфологического контроля.Иммуногистохимические реакции проводились на депарафинированных срезах толщиной 4-5 мкм, расположенных на стеклах, покрытых полилизиновым слоем (Mainzel Glaser, Polylisine, Германия) по стандартной методике (Dako protocols).Неокрашенные срезы от каждого случая обрабатывали с помощью стандартногометода иммуногистохимии с термической демаскировкой антигенов.
Демаскировкупроводили в водяной бане с микропроцессором фирмы «Bio Optica» (Милан): полилизиновые стекла с парафиновыми срезами депарафинировали, а после регидратации погружали в емкости с цитратным буфером (рН=6,0) и нагревали на водянойбане, разогретой до температуры 95°С, в течение 15 минут. Далее стекла охлаждали в емкости с цитратным буфером при комнатной температуре в течение 20 минут, а затем 2х-кратно промывали в фосфатном буфере по 5 минут. С целью блокировки эндогенной пероксидазы остывшие стекла помещали во влажные камеры иинкубировали там в течение 15 минут с 0,3% раствором перекиси водорода Н 2О2.После обработки перекисью предметные стекла ополаскивали в фосфатном буфере(рН=7,0-7,6) и для блокирования неспецифических белковых взаимодействий инкубировали с 1% раствором альбумина Ultra-V-Block (LabVision, USA) во влажныхкамерах в течение 30 минут. По окончании инкубации излишки реагента аккуратностряхивали со стекол и наносили первичные антитела.В качестве первичных специфических антител использовали моноклональныеантитела к CD16 и CD56 (клоны 2Н7 и 1В6 фирмы «Novocastra», Великобритания) –маркерам естественных клеток-киллеров, CD20 (клон L26 фирмы «DAKO», Дания)– маркеру зрелых В-лимфоцитов и HLA-DRII (клон LN-3 фирмы «Novocastra», Великобритания) – функциональному маркеру активации, в совокупности позволяющих судить о наличии, характере (с или без иммунного компонента) и активностивоспалительного процесса в эндометрии в период «окна имплантации».
Для оценкирецептивности эндометрия использовались первичные антитела к эстрогеновым ERи прогестероновым PR рецепторам (клоны 1D5 и 636 фирмы «DAKO», Дания,ready-to-use), лейкемия ингибирующему фактору LIF (R&D Systems, 1:100), клауди-71ну-4 CLDN4 (Lab Vision, ready-to-use) и TLRs2,4, 9(Abbiotec, 1:100), являющимисямаркерами врожденного иммунитета.В зависимости от времени воздействия, предусмотренного фирмой производителем и указанного в спецификации к антителу, полученные срезы инкубировалис первичными антителами в течение 30-60 минут, после чего их отмывали в фосфатном буфере (рН=7,0-7,6) от первичных антител, не связавшихся с эпитопами.Для выявления первичных антител использовали полимерную систему, содержащую декстрановый каркас с многократно присоединенными молекулами ферментапероксидазы хрена и вторичными антителами к антимышиным и антикроличьимиммуноглобулинам.
Время инкубации срезов с полимерной системой во влажныхкамерах составляло 30 минут (EnVision, Dako), по окончании которой срезы 2хкратно ополаскивали в фосфатном буфере (рН=7,0-7,6) по 10 минут. Для выявления места связывания антитела с антигеном использовали реакцию окисления субстрата 3,3-диаминобензидина (ДАБ) пероксидазой хрена в присутствии Н2О2 с образованием нерастворимого в органических растворителях конечного продукта реакции, выявляемого в виде коричневого окрашивания структур клеток и экстрацеллюлярного матрикса. В зависимости от желаемой интенсивности окрашивания срезы инкубировали с ДАБ от 5 до 15 минут, после чего стекла ополаскивали в дистиллированной и водопроводной воде и подкрашивали ядра 10% раствором гематоксилина в течение 2-3 минут.
Затем стекла дегидратировали в ряде, состоящемиз 70% спирта, 80% спирта, 2 95% спиртов, 2 абсолютных спиртов и 3 ксилолов. Взаключении срезы покрывали закрепляющим раствором «Depex», накладывали покровные стекла и изучали посредством световой микроскопии при 400-кратномувеличении (схемы 1, 2).Схема 1Схема приготовления растворов для иммуногистохимических реакций1. 0,3% раствор Н2О2: 2 мл 30% раствора Н2О2 + 200 мл холодной Н2О;2. цитратный буфер (рН=6,0): 10-кратный концентрат: 2,1 г Citrate monohydrate + 900 мл Н2Одист + 13 мл 2N NaOH +Н2Одист до общего объема 1 л; рабочий раствор: 100 мл концентрата + 13 мл 2N NaOH + Н2Одист до общего объема 1 л;3.
фосфатный буфер (рН=7,0-7,6):72 10-кратный концентрат: 14,4 г Na2HPO4*2H2O или 29 г Na2HPO4*12H2O + 80 г NaCl + 2 гKH2PO4 + Н2Одист до общего объема 1 л; рабочий раствор: 100 мл концентрата + 900 мл Н2Одист.Схема 2Протокол постановки иммуногистохимических реакцийна парафиновых срезах толщиной 4-5 мм с полилизиновыми стёклами1. депарафинация: последовательное помещение стекол в ксилол-1, -2 и -3 по 20 мин. в каждый;2. регидратация: полоскание стекол по 5 мин. через батарею спиртов 100%, 96%, 90%, 80% и70% или 100%, 100%, 95% и 95%, а затем дважды по 5 мин.
в дистиллированной воде соднократной сменой воды;3. демаскировка антигенов в водяной бане с микропроцессором Bio Optica в цитратном буфере: стёкла помещают в кассеты и погружают их в емкость с цитратным буфером; емкость с кассетами ставят в водяную баню, разогретую до 95°С, и плотно закрывают; инкубация в водяной бане длится в течение 15 мин. при температуре не более 95°С;4. охлаждение стекол в кассетах в цитратном буфере при комнатной температуре в течение 20 мин.;5. 2х-кратное промывание стекол в фосфатном буфере по 5 мин.;6. блокирование эндогенной пероксидазы: инкубация стекол в 0,3% растворе Н2О2 во влажныхкамерах в течение 20 мин.
при комнатной температуре;7. 2х-кратное промывание стекол в фосфатном буфере по 5 мин.;8. инкубация с 1% раствором альбумина Ultra-V-Block (Lab Vision) во влажных камерах в течение 30мин. с последующим удалением его избытка без дополнительного промывания водой;9. инкубация с первичными антителами, разведенными 10% сывороткой, фосфатным буферомили специальным раствором для разведения антител Abdiluent (Lab Vision) во влажной камерев течение 30-60 мин.;10. 2х-кратное промывание стекол в фосфатном буфере при комнатной температуре по 10 мин.;11. инкубация со вторичными антителами во влажной камере (параллельно готовится авидинстрептовидиновый комплекс (LSAB KIT, DAKO) – за 30 мин.
до его использования);12. 2х-кратное промывание стекол в фосфатном буфере при комнатной температуре по 10 мин.;13. инкубация с авидин-стрептовидиновым комплексом в течение часа при комнатной температуре;14. полоскание в фосфатном буфере в течение 2-5 мин.;15. ДАБ-реакция в течение 5-15 мин.: 1 мл раствора буфера с Н2О2 + 1 капля ДАБ;16. полоскание в дистиллированной воде;17.
промывание в водопроводной воде в течение 5 мин.;18. окраска 10% раствором гематоксилина в течение 2-3 мин.;19. промывание в водопроводной воде в течение 5 мин.;20. регидратация: полоскание стекол по 5 мин. через батарею спиртов 100%, 96%, 90%, 80%, 70% или100%, 100%, 95%, 95%, а затем 2х-кратное полоскание в ксилоле-3, -2, -1 по 5 мин.;21. покрытие стекол закрепляющим раствором Depex и наложение покровного стекла.73Для иммуногистохимических реакций ставили положительные и отрицательные контроли. В качестве отрицательных контролей использовались образцыисследуемых срезов, обработанные по стандартной методике иммуногистохимии,описанной выше, но без добавления первичных антител.
Выбор положительныхконтролей для каждого антитела производился в соответствии со спецификациямиот фирмы производителя.Оценка результатов иммуногистохимических реакций проводилась полуколичественным и количественным методами.Экспрессия СD16, СD20, СD56 и HLA-DRII оценивалась при выполнении световой микроскопии с 400-кратным увеличением путем подсчета положительно окрашенных клеток в 5 полях зрения (Хохлов П.П., 2007). Низкая экспрессия (менее 10положительно окрашенных клеток в поле зрения) СD16, СD56 и HLA-DRII говорит оботсутствии хронического воспалительного процесса в эндометрии.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
