Диссертация (1140149), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Обнаружение гонококков, трихомонад, мицелия,псевдогифов или спор дрожжевого гриба на фоне аналогичной картины воспалениясвидетельствовало о наличии гонореи, трихомониаза или микотического вагинита.Бактериологическое исследование содержимого из цервикального канала ипайпель-биоптата эндометрия выполнялось с целью идентификации культуры возбудителя и установления количественного состава микроорганизмов, выросших наискусственных питательных средах, с последующим определением их чувствительности к антибиотикам и антибактериальным препаратам. Для предупрежденияконтаминации материала исследования микроорганизмами из окружающей средыего забор осуществлялся в асептических условиях стерильными инструментами споследующим его перемещением в стерильную пробирку с транспортной средой иплотно закрывающейся крышкой. Перед забором материала из цервикального канала шейку матки обнажали в зеркалах и стерильным тампоном производили удаление избытка слизи в области наружного зева.
Забор отделяемого из цервикального канала осуществлялся стерильным ватным тампоном, который вводили в цервикальный канал на 0,5-1,5 см и выполняли несколько вращательных движений, после чего тампон аккуратно извлекали через влагалище наружу, не допуская касаниястенок влагалища, быстро помещали его в стерильную пробирку с питательнойсредой и плотно закрывали крышкой. Забор материала из полости матки производили в процессе выполнения аспирационной биопсии эндометрия на 7-10 дни менструального цикла после предварительной обработки шейки матки и цервикального канала 0,05% раствором хлоргексидина с целью минимизации риска контаминации материала микрофлорой нижних отделов половых путей.
Помещенный в пробирку с транспортной средой материал из цервикального канала и полости маткидоставлялся в лабораторию в течение ближайших 1-2 часов после забора.66С целью выделения чистых культур микроорганизмов осуществляли культивирование полученного материала на твердых питательных средах, предварительноразлитых в чашки Петри, при аэробных, микроаэрофильных и анаэробных условиях. Для этого исследуемый материал переносили стерильной микробиологическойпетлей с ватного тампона, помещенного в пробирку с транспортной средой, на специальные питательные среды. В качестве последних для выделения факультативно-анаэробной флоры (стафилококки, стрептококки, коринеформные бактерии, энтеробактерии, бактерии кишечной группы) использовался 5% кровяной агар, который инкубировали в специальных термостатах фирмы «bioMerieux» (Франция) притемпературе 370С в течение 24-96 часов (1-4 суток), причем для роста коринебактерий – в микроаэрофильных условиях.
Для обнаружения облигатно-анаэробныхмикроорганизмов (бактероиды, пептострептококки, эубактерии, фузобактерии,клостридии) полученный материал высевали на среду Шэдлера с добавлением 5%бараньей крови, после чего посевы инкубировали в анаэростатах фирмы «bioMerieux» (Франция) при температуре 370С в течение не менее 72 часов с использованием газогенераторных пакетов этой фирмы. Культивирование лактобактерийосуществляли на MRS-агаре фирмы «Sifin» (Германия) в течение 4 суток при температуре 370С в аэробных и анаэробных условиях.
Для идентификации грибов родаCandida посев материала производили на среду Сабуро и затем в течение суток инкубировали в термостатах при температуре 370С, а далее при температуре 220С втечение 2-5 суток. Для обнаружения Mycoplasma genitalium применяли набор «Mycoplasma Duo» фирмы «Sanofi Diagnostics Pasteur» (Франция), Gardnerella vaginalis– среду Gardnerella-агар фирмы «bioMerieux» (Франция), а Trichomonas vaginalis –среду «Vgicult» фирмы «Orion Diagnostica» (Финляндия), которые инкубировали втермостатах при температуре 370С в течение 1-4 суток. Контроль над поддержанием оптимальных условий культивирования проводился при помощи индикаторованаэробиоза и СО2-индикаторов фирмы «bioMerieux» (Франция).После выделения чистых культур на основании изучения их морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических свойств производили видовую идентификацию патогена (Хоулт Ж., 1997). Количественную оценку возбудителя осуществляли методом секторного посева на плотные питательные среды с67диагностически значимым титром патогена более 104 КОЕ/мл (Фельдман Ю.М.,1984; Страчунский Л.С.
и др., 2007).На заключительном этапе бактериологического исследования определяли чувствительность микроорганизмов, выделенных в этиологически значимых количествах, к антибиотикам. С этой целью применяли диско-диффузионный метод, прикотором после аппликации дисков с антибиотиками на выросшие колонии возбудителей производили инкубацию чашек Петри в термостатах при температуре 370Св течение 18-24 часов с последующей оценкой в отраженном свете диаметра зонзадержки роста микроорганизмов.Исследование микрофлоры цервикального канала и пайпель-биоптата эндометрия методом ПЦР проводилось с целью обнаружения возбудителей инфекций,передающихся половым путем (Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium,Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Trichomonas vaginalis, Gardnerellavaginalis), цитомегаловирусной и герпетической инфекций, а также грибов родаCandida.
Забор материала из эндоцервикса производили стерильным зондом, введенным в цервикальный канал на глубину 0,5-1,5 см, после предварительного удаления шеечной слизи и обработки шейки матки стерильным физиологическим раствором. Зонд аккуратно извлекали из влагалища, полностью исключая касания егостенок, и погружали в стерильную пробирку типа эппендорф с транспортной средой, где производили несколько вращательных движений зондом, после чего зондизвлекали и пробирку плотно закрывали крышкой. Забор материала из полостиматки производили посредством аспирационной биопсии эндометрия на 7-10 днименструального цикла по стандартной методике после предварительной обработкишейки матки и цервикального канала раствором антисептика (см. п.
2.2.3.2). Хранение и транспортировка полученного материала в лабораторию осуществляласьпри температуре +4°С в течение 24-48 часов после его забора.Доставленный в лабораторию материал помещали в амплификатор, где поддействием специальных ферментов происходило многократное удвоение (амплификация) определенного участка ДНК или РНК возбудителя по типу «цепной реакции» с образованием большого количества копий генетического материала, достаточного для визуального анализа. Посредством сравнения результатов амплификации с имеющейся базой данных о строении разных патогенов определяли видовую68принадлежность выявленных в исследуемом материале возбудителей. При обнаружении методом ПЦР Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis и genitalium осуществляли полуколичественную оценку их содержания в 1 мл материала, а такжепроизводили культивирование микроорганизмов на специальной питательной среде с последующим определением их чувствительности к антибиотикам.
Титр более104 КОЕ/мл считался этиологически значимым в отношении наличия воспалительного процесса, вызванного выявленными агентами (Побединский Н.М. и др., 2000).2.2.2.2. Иммунологическое исследование.Иммунологическая диагностика при ХЭ проводилась с целью выявленияаутоиммунного компонента заболевания, о наличии которого свидетельствовалообнаружение циркулирующих в периферической крови женщин органоспецифических антиэндометриальных антител (АЭАТ) в количестве, выше порогового значения (Михнина Е.А., 2009). Определение АЭАТ в сыворотке крови у пациенток обеих исследуемых групп проводилось методом твердофазного иммуноферментногоанализа с использованием специального иммунохимического диагностикума, в качестве которого применялась микросомальная фракция стромальных клеток эндометрия (Марбургский университет имени ландграфа Филлипа, медицинский факультет, Франкфуртская университетская клиника).
Количественный анализ сывороточного уровня АЭАТ у женщин с ХЭ заключался в оценке их содержания относительно нижнего и верхнего пороговых значений, равных 210 и 265 Ед/мл, соответственно. При этом уровень АЭАТ выше нижнего порогового значения указывална возможность, а выше верхнего – на высокую вероятность наличия аутоиммунного синдрома при ХЭ (Михнина Е.А. и др., 2005 – патент № 2303267).Для уточнения аутоиммунной природы заболевания у всех пациенток с ХЭпроводилась дополнительная иммуногистохимическая оценка состояния местногоиммунитета с подсчетом количества лимфоцитов, экспрессирующих маркеры естественных клеток-киллеров CD16 и CD56, зрелых В-лимфоцитов CD20 и маркер активации HLA-DRII (см.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
