Диссертация (1140145), страница 13

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 13)

Моноклональные антитела, специфичные к человеческомуPGII, на поверхности лунок связывают молекулы PGII образца. Лункимикропланшета промывают для удаления не связавшихся компонентов. HRPконьюгированные связывающие антитела (конъюгат) добавляют в лунки, и онивзаимодействуют с молекулами PGII. Лунки промываются, добавляется TMBсубстрат.Развиваетсяголубоеокрашиваниевследствиеферментативногоразрушения гидроген пероксида пероксидазой хрена.

Ферментативная реакцияпрекращаетсяпослевнесенияостанавливающегораствора.Содержимоемикролунок должно стать желтого цвета. Интенсивность окрашивания прямопропорциональна концентрации PGII в исследуемом образце.Приготовление реагентов.Все реагенты и микропланшет прогревают до комнатной температуры(20…25С).Разбавляют промывающий буфер 1:10 (100мл + 900мл) дистиллированнойводой.66Образцы сыворотки разбавляются 1:5 (100 мкл + 400 мкл) разводящимбуфером, их следует тщательно перемешать.Методика исследования.1. В лунки микропланшета в дублях вносят по 100 мкл бланка, калибраторов,контроля и разведенных образцов.

Закрывают лунки клейкой пленкой.Инкубируют 60 минут при комнатной температуре (20…250С).2. Каждую лунку микропланшета промывают 3 раза по 350 мкл растворомпромывающего буфера.3. С помощью дозатора во все лунки микропланшета вносят по 100 мклраствора конъюгата. Закрывают лунки клейкой пленкой и инкубируют 60 минутпри комнатной температуре (20…250С).4.

Каждую лунку микропланшета вновь промывают 3 раза по 350 мклраствором промывающего буфера.5. С помощью дозатора во все лунки микропланшета вносят по 100 мклраствора субстрата. Закрывают лунки клейкой пленкой и инкубируют 30 мин втемном месте при комнатной температуре (20…250С).6. С помощью дозатора во все лунки микропланшета вносят по 100 мклостанавливающего раствора.7. Оптическую плотность получившегося раствора оценивается с помощьюмикропланшетного ридера при длине волны 450 нм.8. Для автоматического установления концентрации PG II использоваликомпьютерные программы, которые на основе полиноминальной кривой,построеннойпокалибровочнымзначениям,устанавливалинеизвестнуюконцентрацию PG II.С целью диагностики атрофических изменений слизистой оболочки желудкаопределение PG II используется вместе с определением PG I для расчета ихсоотношения PGI/PGII.

Согласно инструкции производителя, нормальнымизначениями PG II является диапазон 3-15 мкг/л. Соотношение PGI/PGII линейноуменьшается с увеличением выраженности атрофического гастрита в области тела67желудка. Соотношение PG I и PG II меньше 2,5 показывает наличие у пациентатяжелой атрофии в теле желудка.Определение гастрина-17.Определение G-17-ELISA высшего типа основано на сэндвич-методе, когдаспецифические связывающие антитела к гастрину-17, адсорбированные на лункахмикропланшета, и выявление антител, меченных пероксидазой хрена (HRP),обеспечивает контроль и усиление реакции.Принцип метода.Моноклональныеантитела,специфичныекгастрину-17человеканаполистироловой поверхности лунок, связываются с молекулами гастрина-17,представленными в образце.

Лунки микропланшета промываются для удаленияостатковобразцов.МоноклональныеHRP-коньюгированныеантителасоединяются с молекулами гастрина-17. Лунки микропланшета промываютсяпосле инкубации, и добавляется субстрат – тетраметилбензидин (TMB). Субстратокисляется ферментом (HRP), конечный продукт реакции окрашивается в голубойцвет. Ферментативная реакция прекращается после внесения останавливающегораствора. Интенсивность окрашивания в желтый цвет прямо пропорциональнаконцентрации гастрина-17 в исследуемом образце.Приготовление реагентов.Все реагенты и микропланшет прогревают до комнатной температуры(20…25С).

Разводят концентрат промывающего буфера 1:9 (100 мл + 900 мл)дистиллированной водой.Образцы сыворотки разводят 1:1 (150мкл + 150мкл) разводящим буфером (дляобразцов), тщательно перемешивают.Методика исследования.1. В лунки микропланшета вносят по 100 мкл раствора бланка, калибраторов,контроля и разведенных образцов. Закрывают лунки клейкой пленкой иинкубируют 60 мин при 37С.682. Каждую лунку микропланшета промывают 3 раза по 350 мкл растворомпромывающего буфера.3. С помощью дозатора в лунки микропланшета вносят по 100 мкл раствораконьюгата. Закрывают планшет клейкой пленкой и инкубируют 60 мин при 37С.4.

Каждую лунку микропланшета вновь промывают 3 раза по 350 мклраствором промывающего буфера.5. С помощью дозатора в лунки микропланшета вносят по 100 мклперемешанного раствора субстрата и инкубируют в течение 30 минут прикомнатной температуре (20-25С).6. С помощью дозатора в лунки микропланшета вносят по 100 мклостанавливающего раствора.7. Оптическую плотность получившегося раствора оценивается с помощьюмикропланшетного ридера при длине волны 450 нм.8. Для автоматического установления концентрации G-17 использоваликомпьютерные программы, которые на основе полиноминальной кривой,построеннойпокалибровочнымзначениям,устанавливалинеизвестнуюконцентрацию G-17.Согласно инструкции производителя, нормальными значениями базального G17 является диапазон 1-10 пмоль/л.

У пациентов с положительным анализом наантитела к H.pylori низкие уровни базального G-17 плазмы/сыворотки (<2,0пмоль/л) может свидетельствует о двух возможностях: 1) умеренном или тяжеломатрофическомгастритеантральногоотделажелудкаи/иливысокойкислотопродукции желудка. Если у пациента с низким уровнем базального G-17(<2,0 пмоль/л) нет инфекции H.pylori, то это свидетельствует о высокойкислотопродукции.Определение IgG к H.pylori.ОпределениеантителклассаIgGкН.pyloriоснованонаметодеиммуноферментного анализа (ИФА) с частично очищенным бактериальным69антигеном Н.pylori, адсорбированным на лунках микропланшета, и детекторнымиантителами, меченными пероксидазой хрена (HRP).Принцип метода.Частично очищенный антиген Н.pylori, закрепленный на полистироловойповерхности лунок, связывает антитела класса IgG к Н.pylori, присутствующие всыворотке крови человека.

Лунки микропланшета промываются для удаленияостатков образцов сыворотки. Моноклональные античеловеческие антитела (антиlgG), конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP), связываются с антителами кН.pylori. Лунки повторно промываются; вносится субстрат (ТМБ). Субстратокисляется ферментом до получения окрашенного в голубой цвет конечногопродукта.Ферментативнаяреакцияпрекращаетсяпослевнесенияостанавливающего раствора.

Образцы, содержащие IgG к Н.pylori, приобретаютжелтый цвет. Это соответствует расчетному значению Ед/л > 30.Приготовление реагентов.Все реагенты и микропланшет согревают до комнатной температуры (20-25°С),инкубатор до 37°С. Концентрат промывочного буфера разводят 1:10дистиллированной водой (100 мл + 900 мл).Образцы сыворотки разводят буфером для разведения 1:200 (5 мкл + 995 мкл) итщательно перемешивают.Методика исследования.1. В лунки микропланшета вносят по 100 мкл буфера для разведения,калибратора, отрицательного контроля, положительного контроля и разведенныхобразцов. Закрывают лунки крышкой и инкубируют 30 мин при температуре37°С.2.

Затем каждую лунку микропланшета промывают 3 раза 350 мкл рабочегораствора промывочного буфера.3. С помощью дозатора в лунки микропланшета вводят по 100 мклперемешанного разведенного раствора конъюгата. Лунки закрывают крышкой иинкубируют 30 мин при температуре 37°С.704. Каждую лунку микропланшета вновь промывают 3 раза 350 мкл рабочегораствора промывочного буфера.5. С помощью дозатора в лунки микропланшета вводят по 100 мкл растворасубстрата. Инкубируют 30 мин при комнатной температуре (20-25°С).6.

С помощью дозатора введят в лунки микропланшета по 100 мклостанавливающего раствора.7. Оптическую плотность получившегося раствора оценивается с помощьюмикропланшетного ридера при длине волны 450 нм.8. Для автоматического установления концентрации антител класса IgG кН.pyloriиспользовалиполиноминальнойкомпьютерныекривой,построеннойпрограммы,покоторыенакалибровочнымосновезначениям,устанавливали неизвестную концентрацию антител.В соответствии с инструкцией фирмы производителя значения EIU менее 30указывают на отрицательный результат, т.е. говорят о том, что антител IgG кН.pylori не определяется, или их количество ниже границы определения.

ЗначенияEIU, равные или большие 30, указывают на то, что антитела IgG к Н.pyloriопределяются, поэтому результат теста считается положительным.2.6 Методы диагностики инфекции H.pyloriДля определения H.pylori использовали следующие доступные методики:дыхательный тест с13С-меченной мочевиной, быстрый уреазный тест припроведении ЭГДС, определение антител IgG к H.pylori в сыворотке крови,гистологический метод.2.6.1 Дыхательный тест с 13С-меченной мочевинойПринцип метода: гидролиз меченной стабильным изотопом углерода 13Смочевины, происходящий под действием вырабатываемого Н.pylori ферментомуреазой. Определение в выдыхаемом воздухе отношения концентрацииизотопомеров двуокиси углерода 13СО2 и 12СО2 до и после приема мочевиныпозволяет делать выводы о наличии Н.pylori в организме.71Протокол выполнения 13С-УДТ.• Тест проводится натощак или не ранее, чем через 6 час после утреннегозавтрака.• За 10 мин до приема мочевины пациент принимает 200 мл апельсинового сокас добавлением 2,4 г лимонной кислоты, которые необходимы для замедленияэвакуации водного раствора мочевины из желудка и стандартизации кислотноосновного состояния в желудке.• За 8 мин до приема мочевины отбирается первичная проба выдыхаемоговоздуха.• В момент начала отсчета производится прием 100 мг меченой мочевины вводном растворе (50 мл).• В течение первой–третьей минут после принятия мочевины пациентпринимает горизонтальное положение, лежа поочередно по 1 мин на каждомбоку, чтобы обеспечить контакт мочевины со всей поверхностью желудка.• На 30-й минуте производится отбор контрольной пробы выдыхаемоговоздуха.Пробы отбираются в герметичные стеклянные контейнеры емкостью 50 мл(стеклянная баночка с герметично уплотняющейся пластиковой крышкой) илипластиковые мешки.Анализ проб выдыхаемого воздуха проводился в течение первых суток влаборатории лазерной диагностики Института Общей Физики им.

А.М.ПрохороваРАН, зав.отделом д.ф.-м.н., профессор Е.В. Степанов.2.6.2. Быстрый уреазный тест (тест-система ХЕЛПИЛ, ООО «АссоциацияМедицины и Аналитики», Россия)Основой теста является свойство H.pylori выделять фермент уреазу, котораяучаствует в процессе преобразования мочевины в аммиак и углекислый газ. Врезультате реакции рН среды сдвигается в щелочную сторону, что фиксируется спомощью индикатора.72Протокол выполнения.

Полученный при ЭГДС биоптат слизистой оболочкиантрального отдела желудка помещается на индикаторный диск при помощисухого пинцета. Через 3 мин биоптат снимают с индикаторного диска и оцениваютфакт появления или отсутствия цветового пятна на индикаторном диске.Появление цветового пятна с оттенками синего на индикаторном дискесвидетельствует о наличии уреазной активности биоптата, а тест считаютположительным.2.6.3 Определение антител IgG к H.pylori в сыворотке крови.Проводилось только при первичном обследовании пациента с помощью тестсистемы «Гастропанель» (см.

Характеристики

Список файлов диссертации